HaloTag технология представляет собой многофункциональный технология, которая показала значительных успехов в изоляции больших и малых белковых комплексов из клеток млекопитающих. Здесь мы выделить преимущества этой технологии по сравнению с существующими альтернативами и продемонстрировать его полезность для изучения многочисленные аспекты функции белка внутри клеток эукариот.
Исследования в протеомики взорвалась в последние годы с развитием возможностей масс-спектрометрии, которые привели к характеристике многочисленных протеомов, в том числе от вирусов, бактерий и дрожжей. Для сравнения, анализ протеома человека отстает, частично из-за огромного количества белков, которые должны быть изучены, но и сложности сетей и взаимодействий них настоящих. Чтобы специально решать проблемы понимания человеческого протеома, мы разработали HaloTag технологии для изоляции белка, особенно сильным для изоляции мультибелковых комплексов и позволяет более эффективно захват слабых или переходных взаимодействий и / или белков в низкой численности. HaloTag является генетически закодированы слитый белок тег, предназначенный для ковалентного, конкретные, и быстрое иммобилизации или наклеивания этикеток белков с различными лигандами. Используя эти свойства, многочисленные приложения для клеток млекопитающих были разработаны для характераИзе функцию белка и здесь мы представляем методологии в том числе: белковых выпадающие меню, используемых для открытия новых взаимодействий или функциональных анализов и клеточной локализации. Мы находим значительные преимущества в скорости, специфичности и ковалентной захвата слитых белков на поверхности для протеомного анализа по сравнению с другими традиционными нековалентных подходы. Мы демонстрируем эти и широкий полезность технологии с использованием двух важных эпигенетических белки в качестве примеров, человеческий bromodomain белковых BRD4 и гистондеацетилазы HDAC1. Эти примеры демонстрируют мощь этой технологии в обеспечении открытие новых взаимодействий и характеризующих клеточную локализацию у эукариот, которая будет вместе Дальнейшее понимание функциональных протеомики человека.
Понимание клеточной функции, ответ на стимулы, а также изменения в области развития и / или болезненных состояний, неразрывно связано с де-свертка протеоме на протяжении всех этих различных динамических состояний 1,2. Многое было сделано, чтобы понять протеома низших организмов, однако, учитывая количество белков и все возможные взаимодействия, это было очень сложным в решении протеома человека 1,3-7. Достижения в области масс-спектрометрии значительно позволило способность проводить эти исследования, и здесь мы представляем дополнительный и значительный прогресс с развитием технологии HaloTag как для эффективного захвата белковых комплексов и функциональные характеристики белков человека из клеток млекопитающих 8-10. Эта технология недавно было показано в ряде исследований, является критическим фактором для открытия важных взаимодействий, что позволяет понимания романа функции белка и understandiнг болезни 11-13.
Гибридный белок HaloTag изначально был разработан для решения несколько задач традиционных тегов сродства и антител по сравнению с захвата белка, очистки, и маркировки 8-10. В почти всех методов захвата белка и очистки, существует нековалентных шаг взаимодействие, которое используется для обогащения конкретного белка 14. На этой стадии, белок и / или комплекс может отделять за счет диффузии, особенно если процесс требует часа вместо минут. Для решения этой проблемы, слитый белок был специально разработан для быстро и необратимо взаимодействовать с его лигандами, которые могут быть либо частицы, поверхности, или флуорофоров 9. Поэтому, как только она связана с его лигандом, это остается связанным, который является одним из самых дифференцирующим фактором по сравнению с другими тегами сродства. Также продемонстрировано здесь, является способностьдля решения различных биологических вопросы с одним конструкции, что возможно путем чередования лиганды 9 (рис. 1). Например, чтобы допросить белковых взаимодействий или функцию, поверхностные лиганды используются для захвата белка или комплексов (рис. 1). В отдельном эксперименте, то же слитый белок может быть помечены флуоресцентно изучать клеточную локализацию, торговлей или белкового обмена (рис. 1). Важно помнить, однако, что как только лиганд связан, является ли это поверхностный или флуорофор, она является необратимым, и поэтому другие лиганды не может быть впоследствии связаны в том же эксперименте.
Анализ существующих технологий к карте белковых взаимодействий выявить трудности для эффективного изолировать специфические взаимодействия, в том числе те, которые являются более переходных или находятся в нижней изобилии 1,6,7,14,15. Кроме того, недавняя работа многочисленной группыс показывает обеспокоенность тем, что в рамках традиционных методов изоляции, особенно в области человеческих протеомики, существует значительное количество белковых примесей, которые могут маскировать сигналы от истинных interactors в масс-спектрометрического анализа 16. Свойства, разработанные для белка HaloTag и его совместно разработанные адрес смолы а эти проблемы. В протокол для сложных Pulldowns (рис. 1), связывание комплексов может быть достигнуто в течение 15 мин, и содействие сложный захват и снижение уровней неспецифического связывания 8. Кроме того, необратимо привязки позволяет эффективно захвата низких белков численности и дает возможность использования гораздо меньшим количеством клеток, снова уменьшения фона 8. После того, как захват комплексов устанавливается, протокол включает в себя мягкие условия стирки для поддержания сложной целостности. Элюцию захваченных комплексов может быть выполнена двумя способами и выбору, какой метод диктуется целью вниз по течению анальныйлиз. Если желание заключается в анализе или обнаружить взаимодействующих белков методом вестерн-блоттинга или масс-спектрометрии, то рекомендуется для элюирования комплексы с денатурирующих таких как SDS или мочевины (рис. 1). Это особенно выгодно для масс-спектрометрии как белок, слитый с первоначально HaloTag, названный белок приманки, останется за границу к смоле и, следовательно, не будет доминировать популяцию пептидов, обнаруженных в масс-спектрометрии. Это также означает, однако, что белок приманки, скорее всего, не будет видно при анализе вестерн-блот, значительная разница в качестве по сравнению с другими нековалентными очищения сродства или коллег по immunoprecipitations. Если цель состоит в том, чтобы очистить комплекс нетронутыми, чтобы быть использованы для функциональных исследований, элюирование может быть выполнена с использованием TEV (Tobacco Etch Вирус) протеазу, которая признает родственным последовательность, кодируемую расщепления между слитого белка и белка приманки (рис. 1). ТHESE образцы также могут быть проанализированы методом масс-спектрометрии, но, как показано позже, они будут содержать значительное количество белка приманки, которые могут помешать обнаружению нижней изобилии, определенные interactors.
Здесь мы представляем раскрывающиеся и визуализации протоколы, применяемые к двум важным терапевтических белков, в bromodomain белка BRD4 и гистондеацетилазы, HDAC1 17. Мы показали, с этих примерах взаимодействия с ожидаемыми партнеров, как определено масс-спектрометрии, ферментативной активности после сложного изоляции для HDAC1, и надлежащего клеточной локализации для обоих. Вместе эти результаты демонстрируют многофункциональный характер и силу технологии для характеристики эукариотических белковых взаимодействий и функции.
Здесь представлены две слитые белки, Halo-BRD4 и Halo-HDAC1, характеризуется в эукариотических клетках млекопитающих для экспрессии, белковый комплекс изоляция и активность, и клеточная локализация. В работе с помощью этих различных протоколов, есть несколько важных шагов для успеха каждого эксперимента. Как и в случае с любым слитого белка, уровень экспрессии и размещения тега сам может иметь решающее значение для поддержания физиологии. Поэтому важно учитывать, что N-и / или C-концевые слияния необходимо будет разработан, если предшествующее знание или работать с другой тег не была продемонстрирована для конкретного белка выбора. Что касается выражения, если уровень слишком высок, разбавление ДНК может быть выполнена во время трансфекции или использования векторов с более слабых промоторов можно достичь уровень, соответствующий. Предыдущая работа была выполнена, показывая эффективную изоляцию макромолекулярных комплексов на эндогенный леВелс выражения 8, что позволяет работать при очень низких уровней экспрессии. Если это возможно, исследования Клеточная локализация также будет в состоянии дать представление, как к оптимальному тега позиции размещения, а также относительного уровня экспрессии, необходимой для правильного физиологии.
После того, как слитые белки готовы к выпадающих экспериментов, для получения максимального успеха с протоколом очень важно следовать рекомендациям сроки в лизиса, связывания и стиральных секциях, как один из самых больших преимуществ является скорость комплексной изоляции Процесс. Если любой из этих шагов удлинены во времени, таких как требуется для метода захвата на основе антител, существует риск диссоциации комплекса или возросла неспецифическое связывание 8. Аналогично, если времена укорачиваются во время клеточного лизиса или обязательными, клетки не могут быть полностью лизируют или эффективно захватили соответственно. Если количество стирок является ОВЦСослаблены или хорошее перемешивание смолы не происходит при связывании или стирок, то фоновые уровни неспецифических белков будет увеличено. Кроме того, средства лизиса очень важно по сравнению с эффективностью связывания со смолой. Попытки разрушать ультразвуком образцов, снимите рекомендованным моющим, добавить SDS или другой яркий моющее средство, и / или включают ингибитор протеазы AEBSF приведет к уменьшению или потере связывания белков слияния и их комплексов со смолой.
Существующие методы комплексной изоляции от клеток млекопитающих и протеомики борьбы анализа человеческого с проблемой снижения фона в анализе методом масс-спектрометрии 16. Это было настолько значительным, что хранилищем загрязняющих белков был создан многочисленными масс-спектрометрии групп 16. Фон в образцах масс-спектрометрии выпадающих можно определить как нечто, что предотвращает идентификациюистинные interactors белка приманки. Таким образом, фон может возникнуть в результате загрязнения неспецифические белки или также большие концентрации приманки белка или антител, используемых для осаждения приманки белки. Значительная работа была сделана в оптимизации как протокол выпадающее представленные здесь, а также смолы, чтобы минимизировать уровень неспецифических загрязняющих белков в процессе выпадающего. Это видно в гелях пятно серебряных и масс-спектрометрического анализа контролем (рис. 2). Для решения высоких уровней приманки белка или антител, которые могут быть в равной степени вредны как загрязнители и с которой другие методологии борьбы, пулдаун с SDS вымывания рекомендуется (протокол раздел 2.4). В связи с ковалентного к смоле, этот процесс будет оставить большую часть белка отправной слияния ковалентно присоединенную к смоле. Небольшой процент приманки наблюдается в масс-спектрометрического анализа, который, как полагаютпроисходит путем гидролиза, но это не представляет проблемы для обнаружения других более слабых или переходных взаимодействий 8.
Как уже упоминалось во введении, значительные успехи в протеомики эта возможность включена значительные успехи в масс-спектрометрии 1,7. Таким образом, важно, чтобы выделить важные параметры выбора масс-спектрометрического анализа на deconvolute смесь белков, полученных в Pulldowns. Инструменты должны быть прочными и способны обычно и эффективно анализировать образцы, содержащие небольшое количество белка, часто меньше чем <1 мкг. Наноразмерных хроматографии с участием 50-75 мкм колонны с внутренним диаметром ВЭЖХ с расходом в диапазоне 100-300 Нл / мин обычно используют для совместимости с малыми размерами образца и максимизировать чувствительность масс-спектрометра. Чтобы максимизировать информацию, полученную в одном анализе государственной Oе в искусство масс-спектрометры, способные принимать масс-спектры высокого разрешения в масштабе времени, совместимый с вышеупомянутыми наноразмерных разделений, ≥ 10 Гц, обычно используются. Эти инструменты имеют attomolar уровней чувствительности и может регулярно получать данные с суб стр предшественника и ионных продукт допусков ошибок масса. Эти эксплуатационные характеристики служат для увеличения выхода количества идентифицированных белков и уверенность, связанную с этими идентификаторами.
С помощью этих данных мы демонстрируем физиологическую клеточную локализацию, правильное белок: белковых взаимодействий наряду с потенциалом для открытия новых взаимодействий, и изоляцию активных комплексов все с помощью одного конструкцию. Действительно альтернативные технологии могут быть использованы для каждого из этих различных аспектов, но, вероятно, не для всех 23,24. С помощью технологии HaloTag, многофункциональный подход может быть использован, продвижение протеомныеИС исследования и получения более полного понимания функции белка в клетках млекопитающих.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Мартина Розенберг, доктор Гари Tarpley, и д-р Кейт Вуд для поддержки этой работы, и д-р Джеймс Кали за критическое прочтение рукописи. МГ, JM, HB, Н.М.,, JC, и MU являются сотрудниками Промега Corporation. М.Ф., RJ, РА, Д. А. являются сотрудниками MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |