HaloTag Technologie ist eine Technologie, die multifunktionale bedeutenden Erfolg in Isolation von kleinen und großen Proteinkomplexen aus Säugerzellen gezeigt hat. Hier beleuchten wir die Vorteile dieser Technologie im Vergleich zu bestehenden Alternativen und zeigen ihren Nutzen zu zahlreichen Aspekten der Proteinfunktion innerhalb eukaryotischen Zellen zu studieren.
Forschung in der Proteomik hat in den letzten Jahren Fortschritte in der Massenspektrometrie-Funktionen, die auf die Charakterisierung der zahlreichen Proteomen, auch aus Viren, Bakterien und Hefe führte explodiert. Im Vergleich, die Analyse des menschlichen Proteoms hinkt, teilweise aufgrund der schieren Anzahl von Proteinen, die untersucht werden müssen, sondern auch die Komplexität von Netzwerken und Interaktionen diese vorhanden. Um den Herausforderungen der das Verständnis des menschlichen Proteoms spezifisch anzugehen, haben wir HaloTag Technologie für Proteinisolierung entwickelt, besonders stark für die Isolierung von Multiproteinkomplexen und eine effizientere Erfassung von schwachen oder transiente Wechselwirkungen und / oder Proteine in geringer Menge. HaloTag ist eine genetisch kodierte Protein-Fusion-Tag für die kovalente entworfen, spezifisch und schnelle Immobilisierung oder Markierung von Proteinen mit verschiedenen Liganden. Mit Hilfe dieser Eigenschaften wurden zahlreiche Anwendungen für Säugerzellen zum Charakter entwickeltize Proteinfunktion und hier präsentieren wir Methoden einschließlich: Protein-Pulldown-Menüs für die Entdeckung von neuen Wechselwirkungen oder funktionelle Assays verwendet, und zelluläre Lokalisation. Es ergeben sich signifikante Vorteile in der Geschwindigkeit, Genauigkeit und kovalente Erfassung von Fusionsproteinen zur Proteomanalyse Flächen im Vergleich zu anderen herkömmlichen, nicht-kovalente Ansätze. Wir zeigen diese und die breite Anwendbarkeit der Technologie mit zwei wichtige epigenetische Proteine als Beispiele, das menschliche Protein Bromodomäne BRD4 und Histon-Deacetylase HDAC1. Diese Beispiele zeigen, die Macht dieser Technologie bei, dass die Entdeckung von neuen Interaktionen und Charakterisierung von zellulären Lokalisation in Eukaryoten, die wird, gemeinsam weitere Verständnis der menschlichen funktionelle Proteomik.
Verständnis der zellulären Funktion, die Reaktion auf Reize, und Veränderungen in der Entwicklung und / oder Krankheitszustände ist eng gebunden an de-Faltung des Proteoms in diesen unterschiedlichen dynamischen Zustände 1,2. Es wurde schon viel getan, um das Proteom von niederen Organismen zu verstehen, aber angesichts der Anzahl von Proteinen und alle möglichen Wechselwirkungen hat sich diese sehr herausfordernd bei der Bewältigung der menschlichen Proteoms 1,3-7. Fortschritte in der Massenspektrometrie wurden stark aktiviert die Möglichkeit, diese Untersuchungen durchzuführen, und hier präsentieren wir eine zusätzliche und bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von HaloTag Technologie sowohl für effiziente Erfassung von Proteinkomplexen und funktionelle Charakterisierung von humanen Proteinen aus Säugerzellen 8-10. Diese Technologie wurde kürzlich in mehreren Studien gezeigt worden, daß ein kritischer Faktor für die Entdeckung der wichtigen Wechselwirkungen, so dass für einen Einblick in neue Proteinfunktion und understanding der Erkrankung 11-13.
Die HaloTag Protein-Fusion wurde zunächst auf mehrere Herausforderungen der traditionellen Affinität Tags und Antikörper als im Zusammenhang mit Protein-Capture, Reinigung und Kennzeichnung 10.8 Adresse entwickelt. In nahezu allen Verfahren zur Abtrennung und Reinigung Protein gibt es eine nicht-kovalente Wechselwirkung, die Schritt für die Anreicherung eines bestimmten Proteins 14 verwendet wird. Während dieses Schrittes kann das Protein und / oder komplexe infolge Diffusion trennen, insbesondere wenn das Verfahren erfordert Stunden anstelle von Minuten. Um dieses Problem anzugehen, wurde das Fusionsprotein speziell entwickelt, um schnell und irreversibel die Interaktion mit seinen Liganden, die entweder Teilchen, Flächen oder Fluorophore 9 sein kann. Daher, sobald es an seinen Liganden gebunden bleibt gebunden, was eine der Differenzierungsfaktor im Vergleich zu anderen Affinitätstags ist. Auch hier gezeigt, ist die Fähigkeit,zu unterschiedlichen biologischen Fragen mit einem einzigen Konstrukt, das durch abwechselnde Liganden 9 (Fig. 1) möglich ist, zu adressieren. Zum Beispiel, um Protein-Wechselwirkungen oder Funktion zu befragen, Oberflächenliganden für die Erfassung von Protein oder Komplexe (Fig. 1) verwendet. In einem separaten Experiment, kann das gleiche Fusionsprotein fluoreszenzmarkierten zelluläre Lokalisation, handeln, oder Protein-Turnover (Figur 1) zu untersuchen. Es ist jedoch wichtig zu erinnern, dass, wenn ein Ligand gebunden ist, ob es eine Oberfläche oder ein Fluorophor ist, irreversibel ist und daher andere Liganden kann dann anschließend im gleichen Experiment gebunden.
Analyse bestehender Technologien zur Protein-Interaktionen Karte zeigen die Schwierigkeit, spezifische Wechselwirkungen, einschließlich derjenigen, die mehr transiente oder sind in Hülle und Fülle unteren 1,6,7,14,15 effizient isolieren. Auch neuere Arbeiten von zahlreichen Gruppens zeigt die Sorge, dass innerhalb der traditionellen Isolationsverfahren, insbesondere im Bereich der Menschen Proteomik, gibt es eine beträchtliche Anzahl von Proteinverunreinigungen, die Signale von wahren Interaktoren in der Massenspektrometrie-Analyse 16 maskieren kann. Die für die HaloTag Protein und seine Co-Harz entwickelt Adresse auch diese Bedenken Eigenschaften entwickelt. In 15 Minuten kann das Protokoll für komplexe pulldowns (Abbildung 1), die Bindung von Komplexen erreicht werden, sowohl die Förderung der komplexen Erfassung und Verringerung der Zahl von nicht-spezifischen Bindung 8. Zusätzlich irreversibel bindenden ermöglicht eine effiziente Erfassung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und ermöglicht die Verwendung von viel weniger Zellen wieder reduziert Hintergrund 8. Nach Erfassung der Komplexe hergestellt ist, das Protokoll enthält milde Waschbedingungen zu komplexen Integrität zu erhalten. Elution der aufgenommenen Komplexe können durch zwei Verfahren, und die Entscheidung, welche Methode wird durch das Ziel des stromabwärtigen anal diktiert geführt werdenlyse. Wenn der Wunsch zu analysieren oder zu entdecken interagierenden Proteinen durch Western-Blot oder Massenspektrometrie, dann empfiehlt es sich, Komplexe mit Denaturierungsmitteln wie Harnstoff oder SDS (Fig. 1) eluiert. Dies ist für die Massenspektrometrie besonders vorteilhaft, da das Protein ursprünglich HaloTag fusioniert, bezeichnet das Köderprotein, hinter an das Harz gebunden bleiben und daher nicht die Population von Peptiden, die in der Massenspektrometrie nachgewiesen dominieren. Das bedeutet aber auch, dass der Köder-Protein wahrscheinlich nicht sichtbar in der Analyse durch Western-Blot, ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu anderen nicht-kovalente Affinitätsreinigungen oder Co-Immunpräzipitationen sein. Wenn das Ziel ist, einen Komplex zu reinigen intakt für Funktionsstudien verwendet werden, können die Elution unter Verwendung von TEV (Tobacco Etch Virus)-Protease, die ihre zugehörigen Spaltsequenz zwischen dem Fusionsprotein und dem Köder-Protein (Fig. 1) codiert werden, erkennt. Tiese Proben könnten auch durch Massenspektrometrie analysiert werden, aber, wie später gezeigt wird, werden sie eine erhebliche Menge an Köderprotein, das den Nachweis von unteren Hülle und Fülle, spezifische Interaktoren verhindern kann, enthalten.
Hier präsentieren wir Pulldown-und Imaging-Protokolle, um zwei wichtige therapeutische Proteine, die Protein Bromodomäne BRD4 und Histon-Deacetylase, HDAC1 17 angelegt. Wir haben mit diesen Beispielen, die Interaktion mit Partnern wie erwartet durch Massenspektrometrie, enzymatische Aktivität nach komplexen Isolation für HDAC1 und korrekte zelluläre Lokalisation für beide bestimmt gezeigt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse die multifunktionale Art und Stärke der Technik zur Charakterisierung von eukaryontischen Protein-Wechselwirkungen und Funktion.
Präsentiert werden hier zwei Fusionsproteine, Halo-Halo-BRD4 und HDAC1, in eukaryotischen Säugetierzellen für die Expression gekennzeichnet, Protein-Komplex Isolation und Aktivität und zelluläre Lokalisation. In Arbeits durch diese verschiedenen Protokolle gibt es mehrere wichtige Schritte für den Erfolg eines jeden Versuchs. Wie es der Fall bei jedem Fusionsprotein, Expressionsniveau und die Platzierung der Markierung selbst kann für die Aufrechterhaltung Physiologie. Daher ist es wichtig zu berücksichtigen, dass N-und / oder C-terminale Fusionen müssen entwickelt werden, wenn Vorkenntnisse oder arbeiten mit einem anderen Tag wurde nicht für das jeweilige Protein der Wahl gezeigt. In Bezug auf Ausdruck, wenn der Pegel zu hoch ist, Verdünnung der DNA während der Transfektion oder Verwendung von Vektoren mit schwächeren Promotoren durchgeführt werden, werden möglich, die Höhe, die angemessen ist zu erreichen. Frühere Arbeiten durchgeführt worden ist, die effiziente Isolierung von makromolekularen Komplexen bei endogenen levels Ausdrucks 8, wodurch Arbeit bei sehr niedrigen Expressionsniveaus. Wenn möglich, würde zelluläre Lokalisation Studien auch in der Lage, Einblick in die optimale Platzierung Tag-Position als auch relative Expressionsniveau für die richtige Physiologie benötigt bereitzustellen.
Sobald die Fusionsproteine sind bereit für Pulldown-Experimente, um den maximalen Erfolg mit dem Protokoll ist es sehr wichtig, die empfohlenen Zeitrahmen bei der Lyse folgen, Bindung und Wasch Abschnitte zu erhalten, als einer der größten Vorteile ist die Geschwindigkeit des Komplexes Isolation Prozess. Wenn einer dieser Schritte werden in der Zeit verlängert wird, wie für einen Antikörper-basierten Erfassungsverfahren erforderlich ist, besteht die Gefahr von komplexen Dissoziation oder erhöhte nicht-spezifische Bindung 8. Ebenso, wenn die Zeiten während der zellulären Lyse oder verbindlich sind verkürzt, können die Zellen nicht vollständig lysiert werden oder effizient bzw. gefangen genommen. Wenn die Anzahl der Waschungen ist decrerleichtert bzw. gute Durchmischung des Harzes nicht in der Bindung oder Wasch auftreten, dann Hintergrundwerte von nicht-spezifischen Proteinen erhöht. Außerdem ist das Mittel der Lyse sehr wichtig, da im Zusammenhang mit der Bindungsaffinität zu dem Harz. Versuche, um die Proben zu beschallen, entfernen Sie das empfohlene Reinigungsmittel, fügen SDS oder andere starke Reinigungsmittel und / oder die den Protease-Inhibitor AEBSF wird reduziert oder Verlust der Bindung von Fusionsproteinen und deren Komplexen zu dem Harz führen.
Bestehende Verfahren für komplexe Isolierung aus Säugerzellen und humane Proteom-Analyse Kampf mit der Herausforderung der Reduzierung von Hintergrund in der Analyse durch Massenspektrometrie 16. Dies wurde so bedeutend, dass ein Repository von verunreinigenden Proteinen wurde von zahlreichen Gruppen-Massenspektrometrie 16 erstellt worden war. Hintergrund in der Massenspektrometrie Pulldown-Proben können als etwas, die die Identifizierung der verhindert, dass definiert werdenwahre Interaktoren der Köder-Protein. Als solches kann Hintergrund kontaminieren unspezifische Proteine oder auch hohe Konzentrationen von Köderprotein oder Antikörper verwendet werden, um Proteine auszufällen Köder entstehen. Bedeutende Arbeit wurde bei der Optimierung sowohl die Pulldown-Protokoll hier vorgestellten sowie das Harz, um das Niveau der nicht-spezifischen verunreinigende Proteine im Pulldown-Verfahren minimieren getan. Dies ist in der Silberfärbung Gele und Massenspektrometrie-Analyse der Kontrolle (Fig. 2) deutlich. Um das hohe Niveau der Köderprotein oder Antikörper, die ebenso schaden wie Verunreinigungen und mit welchen anderen Methoden kämpfen kann anzugehen, wird das Pulldown-Elution mit SDS empfohlen (Protokoll Abschnitt 2.4). Aufgrund der kovalenten Bindung an das Harz wird dieser Prozess die Mehrheit der Ausgangsfusionsprotein kovalent an das Harz gebunden verlassen. Ein kleiner Prozentsatz der Köder in der Massenspektrometrie-Analyse, von der angenommen wird beobachtetdurch Hydrolyse auftreten, aber es ist kein Problem für den Nachweis von anderen schwächer oder transiente Interaktionen 8 vorhanden.
Wie in der Einleitung erwähnt, wurden bedeutende Fortschritte in der Proteomik durch wesentliche Fortschritte in der Massenspektrometrie 1,7 aktiviert. Daher ist es wichtig, wichtige Parameter der Wahl der Massenspektrometrieanalyse zu markieren, um die Mischung von Proteinen in den pulldowns erhalten Dekonvolution. Instrumentierung muss robust und in der Lage regelmäßig und effizient Analyse von Proben, die eine kleine Menge an Protein, die oft weniger als <1 ug. Nanoscale-Chromatographie mit 50-75 um Innendurchmesser HPLC-Säulen mit Durchflussraten in der 100-300 nl / min Bereich ist in der Regel für die Kompatibilität mit der kleinen Stichprobengrößen beschäftigt und um die Empfindlichkeit des Massenspektrometers zu maximieren. Um die in einer einzigen Analyse Zustand o gewonnenen Informationen zu maximierenf die Kunst Massenspektrometer zur Akquisition hochauflösende Massenspektren auf einer Zeitskala mit oben genannten nanoskaligen Trennungen kompatibel, ≥ 10 Hz, werden typischerweise verwendet. Diese Instrumente haben attomolaren Empfindlichkeitsstufen und kann routinemäßig Daten mit Sub-ppm-Vorläufer und Produkt-Ionen-Massen-Fehlertoleranzen zu erwerben. Diese Leistungseigenschaften dienen, um die Ausbeute von der Anzahl der identifizierten Proteine und das Vertrauen mit diesen verbundenen Identifikationen zu erhöhen.
Mit diesen Daten belegen wir physiologische zelluläre Lokalisation, richtige Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Potenzial für die Entdeckung von neuen Interaktionen und Isolierung von aktiven Komplexen alle mit einem einzigen Konstrukt. Tatsächlich alternative Technologien für jede dieser verschiedenen Aspekte verwendet werden, aber wahrscheinlich nicht für alle 23,24. Mit der HaloTag Technologie kann eine multifunktionale Ansatz verwendet werden, die Förderung ProteomICs Studien und Erhalten eines besseren Verständnis der Funktion von Proteinen in Säugerzellen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, und Dr. Keith Wood für die Unterstützung dieser Arbeit und Dr. James Cali für das kritische Lesen des Manuskripts. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, und MU sind Mitarbeiter von Promega Corporation. MF, RJ, RA, und DA sind Mitarbeiter von MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |