HaloTag teknolojisi, memeli hücrelerinden, küçük ve büyük protein komplekslerinin izolasyonu ile önemli bir başarı göstermiştir çok fonksiyonlu bir teknolojidir. Burada mevcut alternatiflere göre bu teknolojinin avantajları vurgulamak ve ökaryot hücrelerin içindeki protein fonksiyonunun birçok yönlerini incelemek için onun yararını göstermektedir.
Proteomikte Araştırma virüs, bakteri, maya ve de dahil olmak üzere çok sayıda proteomlarda, karakterizasyonu yol açmıştır kütle spektrometresi yetenekleri gelişmeler ile son yıllarda patladı. Buna karşılık, insan proteomun analizi kısmen çalışılması gereken proteinlerin çokluğu, aynı zamanda ağlar ve etkileşimlerin bu mevcut karmaşıklığı, gerisindedir. Özellikle insan proteomesini anlama zorlukları çözmek için, biz, protein izolasyonu için HaloTag teknolojisini geliştirdi multiprotein kompleksleri izolasyonu için özellikle güçlü ve düşük bolca zayıf veya geçici etkileşimler ve / veya proteinlerin daha verimli yakalama izin var. HaloTag genetik olarak kodlanmış protein füzyon, kovalent için tasarlanmış etiket, özel ve hızlı immobilizasyon veya çeşitli ligandlarla proteinlerin etiketleme. Bu özellikleri yararlanan, memeli hücreleri için çok sayıda uygulama karakter için geliştirilmiştirprotein işlevi ize ve burada biz dahil yöntemlerini sunuyoruz: Protein roman etkileşimleri veya fonksiyonel deneyleri keşif için kullanılan çekme-çıkışlar, ve hücresel lokalizasyonu. Bu hız, özgüllük, ve diğer geleneksel olmayan kovalent yaklaşımlara kıyasla proteomik analiz için yüzeyleri için füzyon proteinlerinin kovalent yakalama önemli avantajlar bulabilirsiniz. Bu ve bunun örnekleri, insan bromodomain protein BRD4 ve histon deasetilaz HDAC1 olarak iki önemli epigenetik proteinleri kullanılarak teknolojinin geniş bir kullanım gösterilmektedir. Bu örnekler yeni etkileşimlerin keşfini sağlayan ve ökaryotlarda hücresel lokalizasyonu karakterize bu teknolojinin gücünü göstermek, hangi olacak insan işlevsel proteomiks birlikte başka bir anlayış.
Hücresel fonksiyonun, uyaranlara yanıt, kalkınma ve / veya hastalık durumlarında değişiklikler anlayış girift bu farklı dinamik devletlerin 1,2 genelinde proteomun de kıvrımlı bağlıdır. Çok proteinlerin sayısı ve tüm olası etkileşimleri göz önüne alındığında, bu insan proteomesini 1,3-7 ele çok zor olmuştur, bununla birlikte, daha düşük organizmaların proteomesini anlamak için yapılmıştır. Kütle spektrometresi gelişmeler büyük ölçüde bu çalışmaları üstlenmek yeteneği sağlamıştır, ve burada protein kompleksleri ve memeli hücrelerinde 8-10 insan proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu hem verimli yakalanması için HaloTag teknolojinin gelişmesi ile ek ve önemli bir ilerleme mevcut. Bu teknoloji yakın zamanda yeni bir protein fonksiyonunun ve understandi fikir sağlayan, önemli etkileşimlerin keşfi için kritik bir faktör olduğu çeşitli çalışmalarda gösterilmiştirHastalığın 11-13 ng.
HaloTag proteini füzyon başlangıçta geleneksel afinite etiketleri ve protein yakalama, saflaştırma ve etiketleme 8-10 ilişkili olarak antikorların çeşitli zorlukları gidermek için geliştirilmiştir. Yakalama ve protein saflaştırma için hemen hemen tüm yöntemler dahilinde, özel bir proteinin 14 zenginleştirilmesi için kullanılan bir kovalent olmayan etkileşim aşaması yoktur. Bu adım sırasında, protein ve / veya karmaşık işleminin tamamlanması saat yerine dakika gerektirir, özellikle difüzyon nedeniyle kesmek olabilir. Bu sorunu gidermek için, füzyon proteini, özellikle, hızlı ve geri dönüşü olmayan partiküller, yüzeyler ya da flüorofor 9 ya da olabilir, ligandlarına etkileşim üretilmiştir. Bu nedenle ligandına bağlı bir kez, diğer afinite etiketleri ile karşılaştırıldığında en önemli ayırt edici faktör biri olan, bağlı kalır. Ayrıca burada gösterdi yeteneğidirligandlar 9 (Şekil 1) alternatif mümkündür tek bir konstruktun, farklı biyolojik soruları için. Örneğin, protein etkileşimleri veya işlevi sorgulamak için, bir yüzey proteini ya da ligand komplekslerinin yakalama (Şekil 1) için kullanılır. Ayrı bir deneyde, aynı füzyon proteini floresan hücresel yerleşimi kaçakçılığı veya protein ciro (Şekil 1) çalışma etiketli olabilir. Bu ligand irreversible, bu bir yüzey ya da bir florofor olup olmadığını, bağlı olduğu ve bu nedenle diğer ligandlar daha sonra daha sonra aynı deneyde bağlı olamaz ancak bu kez hatırlamak önemlidir.
Protein etkileşimlerini eşleştirmek için mevcut teknolojiler analizi verimli bir şekilde daha fazla geçici ya da daha düşük bolca 1,6,7,14,15 içinde olduğu olanlar da dahil olmak üzere spesifik etkileşimler, izole etmek için bir zorluk ortaya çıkarmaktadır. Çok sayıda grup tarafından da, son işs, geleneksel izolasyon yöntemleri içinde, özellikle de insan proteomik alanında, kütle spektrometrisi analizi 16 için de geçerlidir Uygulayıcılar sinyalleri maskeleyebilir kirletici protein önemli bir sayıda olduğu ilgi göstermektedir. HaloTag protein ve iyi eş gelişmiş reçine adresi bu endişeleri için geliştirilen özellikleri. In komplekslerinin bağlayıcı kompleks Pulldowns için protokol (Şekil 1), her ikisi de kompleks yakalama teşvik eden ve spesifik olmayan bağlanma 8 seviyelerini düşürmek için, 15 dakika içinde elde edilebilir. Buna ek olarak, geri dönüşü olmayan bağlanması düşük bolluk proteinlerin etkin yakalama sağlar ve daha az hücrelerin kullanımına izin verir, daha arka 8 azaltır. Komplekslerinin yakalama kurulduktan sonra, protokol karmaşık bütünlüğünü korumak için hafif yıkama koşulları içerir. Yakalanan komplekslerinin elüsyon yöntem olup, alt anal hedef tarafından dikte edilir ve iki yöntem seçimi ile gerçekleştirilebilirYsis. Arzu analiz ya da Western blot ya da kütle spektrometrisi ile etkileşen proteinleri bulmak için ise, o zaman bu tür SDS ve üre (Şekil 1) gibi denatüranlar ile kompleksler elüt edilmesi için tavsiye edilir. Bu aslında HaloTag kaynaşık protein, yem protein olarak adlandırılan gibi, reçineye bağlı geride kalır ve bu nedenle, kütle spektrometrisi tespit peptit popülasyonunu hakim olmaz kütle spektrometresi için özellikle avantajlıdır. Bu aynı zamanda, yem protein muhtemelen western blot, diğer kovalent olmayan afinite saflaştırma veya ko-İmmüno ile karşılaştırıldığında önemli bir fark ile analiz görünür olmayacaktır, ancak anlamına gelir. Amaç fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere karmaşık bir sağlam arındırmak için ise, elüsyon füzyon proteini ve yem protein (Şekil 1) ile kodlanan ile aynı soydan gelen bölünme dizisini tanır TEV (Tütün Etch Virüsü) proteaz kullanılarak gerçekleştirilebilir. THese örnekleri ayrıca kütle spektrometresi ile analiz edilebilir, ancak daha sonra gösterildiği gibi, daha düşük bolluk saptanmasını, özel inter aktörlerin engelleyebilir yem, proteinin önemli bir miktarda ihtiva edecektir.
Burada iki önemli terapötik proteinler, protein bromodomain BRD4 ve bir histon deasetilaz, HDAC1 17 uygulanır açılan ve görüntüleme protokolleri mevcut. Kütle spektrometrisi, HDAC1 karmaşık izolasyon sonrasında enzimatik aktivite, ve her ikisi için uygun hücresel lokalizasyonu ile belirlendiği gibi biz beklenen ortakları ile, bu örnekler, etkileşim ile göstermiştir. Birlikte bu sonuçlar, ökaryotik protein etkileşimleri ve fonksiyon karakterizasyonu için teknolojinin çok fonksiyonlu doğası ve gücü göstermektedir.
İki füzyon proteinleri, Halo-BRD4 ve Halo-HDAC1, ökaryotik ekspresyon için, memeli hücrelerinde, özelliği protein kompleksi, izolasyon ve aktivitesi ve hücresel lokalizasyon burada sunulmuştur. Bu çeşitli protokoller aracılığıyla çalışan, her deney başarısı için bazı önemli adımlar vardır. Kendisi fizyolojisi korumak için kritik olabilir etiketin herhangi bir füzyon proteini ekspresyon seviyesi ve yerleştirme ile olduğu gibi. Bu önce bilgi ya da başka bir etiket ile çalışmak tercih edilen özel bir protein için gösterilen edilmemiş ise N-ve / veya C-terminal füzyonları tasarlanmış olması gerekir dikkate almak önemlidir. Seviyesi çok yüksek ise, ifade ile ilgili olarak, DNA uygun olan seyreltme seviyesine ulaşmak için daha zayıf promotörler ile vektörlerin transfeksiyon ya da kullanımı sırasında mümkün olan gerçekleştirilebilir. Önceki iş endojen le makromoleküler komplekslerin etkili izolasyonunu gösteren gerçekleştirilir olmuşturİfade çok düşük seviyelerde çalışmasını sağlayan ifadenin 8. VELS. Mümkünse, hücresel lokalizasyon çalışmaları da uygun fizyolojisi için gerekli en uygun etiket yerleştirme pozisyonu yanı sıra göreceli ifade seviyesi olarak bakış açısı sağlamak mümkün olacaktır.
Füzyon proteinlerinin en büyük avantajlarından biri olarak karmaşık izolasyon hızıdır, bu bağlayıcı, lizis tavsiye edilen zaman dilimlerini takip etmek çok önemlidir protokolü ve yıkama bölümleri ile maksimum başarı elde edilmesi için, açılan deneyler için hazır sonra süreci. Bu adımların her zaman içinde uzatılmış ise gibi bir antikor bazlı yakalama yöntemi için gerekli olan, karmaşık bir ayrışma riski ya da 8, artan bağlama spesifik olmayan yoktur. Kez hücresel lizis veya bağlayıcı sırasında kısalır Benzer şekilde eğer, hücreleri tamamen parçalanır ya da verimli sırasıyla ele olmayabilir. Yıkama sayısı decr iseazaltılması veya reçinenin iyi bir karıştırma bağlayıcı ya da yıkama sırasında meydana gelmez, daha sonra non-spesifik proteinler arka plan düzeyi artırılacaktır. Ayrıca, liziz araçlarının reçinesine bağlanma etkisi ile ilgili olarak çok önemlidir. , Örnekleri sonikasyon önerilen Deterjanı ortadan kaldırmak, ya da diğer güçlü SDS deterjanı ve / veya proteaz inhibitörü AEBSF eklemek için girişimler azaltılmış veya reçineye füzyon proteinleri ve komplekslerinin bağlanmasının kaybı ile sonuçlanacaktır.
Memeli hücrelerinde ve kütle spektrometresi 16 tarafından analiz arka plan azaltılması meydan insan proteomik analiz mücadeleden karmaşık izolasyonu için mevcut yöntemler. Bu kirletici proteinlerin bir depo çok sayıda kütle spektrometresi gruplar 16 tarafından yaratılmış olan o kadar önemli olmuştur. Kütle spektrometrisi açılan örneklerde Arka tanımlanmasını önleyen bir şey olarak tanımlanabiliryem protein doğru Uygulayıcılar. Bu nedenle, arka plan non-spesifik proteinler ya da protein yem veya yem proteinleri çökeltmek için kullanılan antikor konsantrasyonları büyük kirletici ortaya çıkabilir. Önemli çalışma Burada yer alan açılan protokolü gibi açılan işleminde spesifik olmayan kirletici proteinlerin düzeyi en aza indirmek için her iki reçine optimize yapıldı. Bu, gümüş leke jeller ve denetimin kütle spektrometresi analizi (Şekil 2) belirgindir. Yem protein ya da başka yöntemler ile mücadele ettiği gibi kirletici maddeler ve aynı derecede zararlı olabilir antikorların yüksek düzeyde ele almak için, SDS elüsyon ile açılan (Protokol Bölüm 2.4) tavsiye edilir. Nedeniyle reçineye kovalent bağlanması için, bu işlem, kovalent olarak reçineye bağlanmış başlangıç füzyon proteininin çoğunluğu bırakacaktır. Yem küçük bir kısmı inanılmaktadır kütle spektrometresi analizi görülmektedirhidroliz yoluyla ortaya çıkarmak için, ancak diğer zayıf ya da geçici etkileşimleri 8 tespiti için bir sorun teşkil etmez.
Girişte belirtildiği gibi, proteomikteki önemli gelişmeler kütle spektrometresi 1,7 önemli gelişmeler etkin olmuştur. Bu nedenle, bu Pulldowns elde proteinlerin karışımı deconvolute için kütle spektrometresi analizi seçimi önemli parametreleri vurgulamak önemlidir. Aletler sağlam ve rutin ve verimli bir şekilde <1 ug genellikle daha az proteinin küçük bir miktar ihtiva eden numune analiz yeteneğine sahip olmalıdır. 100-300 nl / dk aralığında akış oranları ile 50-75 mikron iç çapı HPLC kolonları içeren nano ölçekli kromatografisi genellikle küçük örneklem büyüklüğü ile uyumluluk için kullanılır ve kütle spektrometresi hassasiyetini maksimize etmek. Tek bir analiz devlet o edindiği bilgi maksimize etmekf Anılan nano ayrımları ile uyumlu bir zaman ölçeğinde, ≥ 10 Hz yüksek çözünürlüklü kütle spektrumları elde edebilen sanat kütle spektrometre, tipik istihdam edilmektedir. Bu araçlar duyarlılık attomolar düzeyleri ve rutin alt ppm öncüsü ve ürün iyon kütle hata toleransları ile veri elde edebilirsiniz. Bu performans özellikleri tespit proteinlerin sayısının verimi ve bu kimlik bilgileri ile ilişkili güven artırmak için vermektedir.
Yeni etkileşimleri keşfi için potansiyeli ile birlikte protein etkileşimleri ve tek bir yapı kullanılarak, aktif komplekslerin izole: Bu bilgiler ile, fizyolojik hücresel lokalizasyonunu, doğru protein göstermektedir. Gerçekten de alternatif teknolojiler, ancak muhtemelen tüm 23,24 için, bu farklı yönlerinin her biri için kullanılabilir. HaloTag teknoloji ile, çok fonksiyonlu bir yaklaşım proteom ilerleyen kullanılabilirICS çalışmaları ve memeli hücrelerinde protein fonksiyonunun daha tam bir anlayış elde edilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz yazının eleştirel okuma için Dr Martin Rosenberg, Dr Gary Tarpley, ve Dr Keith Wood, bu çalışmaları desteklemek için, ve Dr James Cali teşekkür ederim. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, ve MU Promega Corporation çalışanlarıdır. MF, RJ, RA, ve DA MS BIOWORKS, LLC çalışanlarıdır.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |