HaloTag teknologi er en multifunktionel teknologi, som har vist stor succes i isolering af både små og store protein-komplekser fra pattedyrceller. Her vil vi fremhæve fordelene ved denne teknologi i forhold til de eksisterende alternativer og vise sin nytte at studere mange aspekter af protein funktion inde eukaryote celler.
Forskning i proteomics er eksploderet i de seneste år med fremskridt inden massespektrometri kapaciteter, der har ført til karakterisering af talrige proteomer, herunder fra vira, bakterier og gær. I sammenligning, analyse af den menneskelige proteom halter bagefter, dels på grund af det store antal af proteiner, som skal studeres, men også kompleksiteten af netværk og interaktioner disse tilstedeværende. Til specifikt at tage udfordringerne i at forstå den menneskelige proteom, har vi udviklet HaloTag teknologi for protein isolation, særligt stærke til isolering af multiprotein komplekser og muliggøre en mere effektiv opsamling af svage eller forbigående interaktioner og / eller proteiner i lav tæthed. HaloTag er et genetisk kodede protein fusion tag designet til covalent, specifikke og hurtige immobilisering eller mærkning af proteiner med forskellige ligander. Udnyttelse af disse ejendomme, blev adskillige applikationer til pattedyrceller udviklet karakterize proteinernes funktion og her præsenterer vi metoder herunder: protein pull-downs, der anvendes til opdagelse af nye interaktioner eller funktionelle assays og cellulær lokalisering. Vi finder betydelige fordele i den hastighed, specificitet og kovalente indfangning af fusionsproteiner til overflader for proteom analyse i forhold til andre traditionelle ikke-kovalente tilgange. Vi viser disse og den brede anvendelighed af teknologi ved hjælp af to vigtige epigenetiske proteiner som eksempler, den menneskelige bromodomain protein BRD4 og histondeacetylase HDAC1. Disse eksempler viser kraften i denne teknologi gøre det muligt for opdagelsen af nye interaktioner og karakterisere cellulære lokalisering i eukaryoter, som vil tilsammen yderligere forståelse af menneskelige funktionelle proteomics.
Forståelse af cellulære funktion, respons på stimuli, og ændringer i udviklings-og / eller sygdomstilstande er uløseligt bundet til de-convolution af proteom gennem disse forskellige dynamiske tilstande 1,2. Der er gjort meget for at forstå proteom af lavere organismer imidlertid i betragtning af antallet af proteiner, og alle mulige interaktioner, har dette været meget udfordrende i håndteringen af menneskelige proteom 1,3-7. Fremskridt i massespektrometri i høj grad har gjort det muligt for evnen til at foretage disse undersøgelser, og her præsenterer vi en yderligere og betydelig fremgang med udviklingen af HaloTag teknologi til både effektiv opsamling af protein komplekser og funktionel karakterisering af humane proteiner fra pattedyrceller 8-10. Denne teknologi er for nylig blevet vist i adskillige undersøgelser at være en kritisk faktor for opdagelsen af vigtige interaktioner, giver mulighed for indblik i hidtil ukendt protein funktion og understanding sygdom 11-13.
Den HaloTag proteinfusion blev oprindeligt udviklet til at løse en række udfordringer for de traditionelle affinitetsmærker og antistoffer som relateret til protein capture, rensning, og mærkning 8-10. Inden for næsten alle metoder til protein-opsamling og rensning, der er en ikke-kovalent interaktion trin, som anvendes til berigelse af et bestemt protein 14. Under dette trin kan de proteiner og / eller komplekse adskille følge af diffusion, især hvis processen kræver timer i stedet for minutter. For at løse dette problem blev fusionsproteinet specielt udviklet til at hurtigt og irreversibelt interagere med dets ligander, som kan være enten partikler, overflader, eller fluoroforer 9. Derfor, når det er bundet til dets ligand, det forbliver bundet, som er en af de mest differentierende faktor i forhold til andre affinitetsmærker. Også vist her, er evnentil at løse forskellige biologiske spørgsmål med en enkelt konstruktion, hvilket er muligt ved skiftevis ligander 9 (fig. 1). For eksempel for at forespørge protein interaktioner eller funktion, overflade ligander anvendes til indfangning af protein eller komplekser (Figur 1). I et separat eksperiment, kan det samme fusionsprotein være fluorescens-mærkede til at studere cellulære lokalisering, menneskehandel eller protein omsætning (Figur 1). Det er vigtigt at huske dog, at når en ligand er bundet, om det er en overflade eller en fluorofor, er irreversibel, og derfor andre ligander kan derefter ikke efterfølgende er bundet i det samme eksperiment.
Analyse af eksisterende teknologier til at kortlægge protein interaktioner afslører vanskeligheden til effektivt at isolere specifikke interaktioner, herunder dem, som er mere forbigående eller er lavere overflod 1,6,7,14,15. Også seneste arbejde ved talrige gruppes viser bekymring for, at inden for de traditionelle isolation metoder, især på området for menneskelige proteomics, er der et betydeligt antal proteinkontaminanter der kan skjule signaler fra sande interaktionskandidater i massespektrometrianalyse 16. De egenskaber, der er udviklet til HaloTag protein og dets co-udviklet harpiks adresse godt disse bekymringer. I kan opnås protokollen for komplekse pulldowns (figur 1), binding af komplekser i 15 minutter, både fremme kompleks opsamling og mindske omfanget af ikke-specifik binding 8. Desuden irreversibelt bindende muliggør effektiv indfangning af lav hyppighed proteiner, og giver mulighed for anvendelse af langt færre celler, igen reducere baggrund 8. Når indfangning af komplekser er etableret, protokollen omfatter milde vaske betingelser for at opretholde komplekse integritet. Eluering af tilfangetagne komplekser kan udføres af to metoder og vælge, hvilke metode er dikteret af målet for den nedstrøms analradiokemiske analyser. Hvis ønsket er at analysere eller opdage interagerende proteiner ved Western blot eller massespektrometri, så anbefales det at eluere komplekser med denatureringsmidler, såsom SDS eller urinstof (figur 1). Dette er særligt fordelagtigt for massespektrometri som proteinet oprindeligt blev fusioneret til HaloTag, betegnet agn protein forbliver bag bundet til harpiksen, og derfor ikke vil dominere populationen af peptider detekteret i massespektrometri. Dette betyder imidlertid også, at lokkemaden proteinet sandsynligvis ikke vil være synlig i analyse ved western-blot, en væsentlig forskel i forhold til andre ikke-kovalente affinitet oprensninger eller co-immunfældninger. Hvis målet er at rense en kompleks intakt skal anvendes til funktionelle undersøgelser kan elueringen udføres under anvendelse af TEV (Tobacco Etch Virus) protease, som genkender dets kognate spaltning kodes mellem fusionsproteinet og agn protein (figur 1). Tisse prøver kan også analyseres ved massespektrometri, men som senere viser sig, vil de indeholde en betydelig mængde af lokkemad protein, der kan forhindre detektion af lavere overflod specifikke interaktionskandidater.
Her præsenterer vi pulldown og billedbehandling anvendte protokoller til to vigtige terapeutiske proteiner, den bromodomain protein BRD4 og en histondeacetylase, HDAC1 17.. Vi har vist med disse eksempler, interaktion med forventede partnere som bestemt ved massespektrometri, enzymatiske aktivitet efter komplekse isolation for HDAC1, og korrekt cellulær lokalisering for begge. Tilsammen viser disse resultater multifunktionelle natur og styrke af teknologien til karakterisering af eukaryote protein interaktioner og funktion.
Præsenteret her er to fusionsproteiner, Halo-BRD4 og Halo-HDAC1, kendetegnet ved eukaryote mammale celler til ekspression, protein kompleks isolation og aktivitet og cellulær lokalisering. I arbejdet gennem disse forskellige protokoller, der er flere vigtige skridt for succes i hvert forsøg. Som det er tilfældet med enhver fusionsprotein ekspressionsniveau og placering af etiketten i sig selv kan være kritisk for opretholdelse af fysiologi. Det er derfor vigtigt at overveje, at N-og / eller C-terminale fusioner skal udformes, hvis forudgående viden eller arbejde med et andet mærke ikke er påvist for det særlige protein valg. Med hensyn til udtryk, hvis niveauet er for højt, fortynding af DNA kan udføres under transfektion eller brug af vektorer med svagere initiativtagerne muligt at nå det niveau, der er passende. Tidligere arbejde har udført viser en effektiv isolering af makromolekylære komplekser på endogene leveauer udtryksformer 8, så arbejde på meget lave niveauer af udtryk. Hvis det er muligt, ville cellulære lokalisering undersøgelser også være i stand til at give indsigt i den optimale tag placering position samt relative udtryk niveau, der kræves for korrekt fysiologi.
Når fusionsproteineme er klar til pulldown eksperimenter, for at opnå maksimal succes med protokollen er det meget vigtigt at følge de anbefalede tidsrammer i lysis, binding og vask sektioner, som en af de største fordele er hastigheden af den komplekse isolation proces. Hvis nogen af disse trin er forlænget i tid, som er nødvendig for et antistof-baserede capture metode, er der en risiko for kompleks dissociation eller øget ikke-specifik binding 8. Tilsvarende hvis tiderne afkortes under cellelyse eller bindende celler kan ikke fuldstændigt lyseret eller effektivt fanget hhv. Hvis antallet af vaske er Decrlempet eller god blanding af harpiksen ikke forekommer i løbet af de bindende eller vasker, så baggrundsniveauer af ikke-specifikke proteiner vil blive øget. Også midler lysis er meget vigtigt som relateret til bindingen effektivitet til harpiksen. Forsøg på at sonikeres prøverne, fjerne det anbefalede rengøringsmiddel, tilføjer SDS eller andre stærke rengøringsmidler og / eller indeholder den proteasehæmmer AEBSF vil resultere i nedsat eller tab af binding af fusionsproteiner og deres komplekser til harpiksen.
Eksisterende metoder til komplekse isolation fra pattedyrceller og menneskelige proteom analyse kamp med den udfordring at reducere baggrunden i analyse ved massespektrometri 16.. Det har været så kraftig, at en samling af forurenende proteiner er skabt af talrige massespektrometri grupper 16. Baggrund i massespektrometri pulldown prøver kan defineres som noget, der forhindrer identifikation afsande interaktionskandidater af agn protein. Som sådan kan baggrund stammer fra kontaminerende non-specifikke proteiner eller også store koncentrationer af agn protein eller antistoffer, der anvendes til udfældning af bait-proteiner. Signifikant arbejde blev udført i at optimere både pulldown protokollen fremlagt her, såvel som harpiksen for at minimere størrelsen af de ikke-specifikke kontaminerende proteiner i pulldown proces. Dette er tydeligt i de sølvfarvning geler og massespektrometri-analyse af kontrollen (figur 2). For at imødegå de høje niveauer af agn protein eller antistoffer, der kan være lige så skadelig som forurenende stoffer og med hvilke andre metoder kæmper, er rullemenuen med SDS eluering anbefales (Protokol afsnit 2.4). På grund af den kovalente binding til harpiksen, vil denne proces lade hovedparten af udgangsmaterialet fusionsproteinet kovalent bundet til harpiksen. Der observeres en lille procentdel af lokkemad i massespektrometrianalyse, som menesat ske gennem hydrolyse, men det udgør ikke et problem for påvisning af andre svagere eller forbigående interaktioner 8.
Som nævnt i indledningen, har betydelige fremskridt i proteomics blevet aktiveret af betydelige fremskridt i massespektrometri 1,7. Derfor er det vigtigt at fremhæve vigtige parametre til valget af massespektrometrianalyse at deconvolute blandingen af proteiner opnået i pulldowns. Instrumentering skal være robust og i stand til rutinemæssigt og effektivt at analysere prøver indeholdende en lille mængde af protein, ofte mindre end <1 ug. Nanoscale kromatografi involverer 50-75 um interne diameter HPLC kolonner med flowhastigheder på 100-300 nl / min rækkevidde er typisk ansat for kompatibilitet med de små stikprøvestørrelser og for at maksimere følsomheden af massespektrometer. For at maksimere de oplysninger erhvervet i en enkelt analyse state of the art massespektrometre kan registrere Højopløsningsmassespektre på en tidsskala kompatibel med førnævnte nanoskala separationer, ≥ 10 Hz, er typisk ansat. Disse instrumenter har attomolar niveauer af følsomhed og kan rutinemæssigt erhverve data med sub ppm forløber og produkt ion masse tolerancerne. Disse egenskaber tjener til at forøge udbyttet af antallet af identificerede proteiner og tilliden forbundet med disse identifikationer.
Med disse data, vi demonstrere fysiologiske cellulære lokalisering, ordentlig protein: protein interaktioner sammen med potentiale for opdagelsen af nye interaktioner, og isolering af aktive komplekser der alle bruger en enkelt konstruktion. Faktisk alternative teknologier kan bruges til hver af disse forskellige aspekter, men sandsynligvis ikke for alle 23,24. Med HaloTag teknologi, kan en multifunktionel tilgang anvendes fremrykkende proteomics undersøgelser og opnå en mere fuldstændig forståelse af proteinfunktion i pattedyrceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, og Dr. Keith Wood til støtte for dette arbejde, og Dr. James Cali for kritisk læsning af manuskriptet. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, og MU er medarbejdere i Promega Corporation. MF, RJ, RA, og DA er ansat i MS Bioworks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |