HaloTag प्रौद्योगिकी स्तनधारी कोशिकाओं से छोटे और बड़े दोनों प्रोटीन परिसरों के अलगाव में महत्वपूर्ण सफलता दिखाया गया है जो एक multifunctional प्रौद्योगिकी है. यहाँ हम मौजूदा विकल्पों की तुलना में इस तकनीक का लाभ पर प्रकाश डाला और कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन समारोह के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अपनी उपयोगिता प्रदर्शित करता है.
प्रोटिओमिक्स में रिसर्च वायरस, बैक्टीरिया और खमीर से उन सहित कई proteomes, के लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व किया है कि जन स्पेक्ट्रोमेट्री क्षमताओं के क्षेत्र में प्रगति के साथ हाल के वर्षों में विस्फोट किया है. इसकी तुलना में, मानव proteome के विश्लेषण के कारण आंशिक रूप से अध्ययन किया जाना चाहिए, जो प्रोटीन की सरासर संख्या है, लेकिन यह भी नेटवर्क और बातचीत के इन वर्तमान की जटिलता को, पीछे है. विशेष रूप से मानव proteome समझने की चुनौतियों का सामना करने के लिए, हम, प्रोटीन अलगाव के लिए HaloTag तकनीक विकसित multiprotein परिसरों के अलगाव के लिए विशेष रूप से मजबूत और कम बहुतायत में कमजोर या क्षणिक बातचीत और / या प्रोटीन की अधिक कुशल कब्जा इजाजत दी है. HaloTag एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन संलयन सहसंयोजक के लिए डिजाइन टैग,, विशिष्ट, और तेजी से स्थिरीकरण या विभिन्न ligands के साथ प्रोटीन की लेबलिंग है. इन संपत्तियों का इस्तेमाल, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए कई आवेदन चरित्र के लिए विकसित किए गएप्रोटीन समारोह ize और यहाँ हम सहित के तरीके मौजूद: प्रोटीन उपन्यास बातचीत या कार्यात्मक assays की खोज के लिए इस्तेमाल पुल चढ़ाव, और सेलुलर स्थानीयकरण. हम गति, विशिष्टता, और अन्य परंपरागत गैर सहसंयोजक दृष्टिकोण की तुलना में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए सतहों के लिए संलयन प्रोटीन के सहसंयोजक कब्जे में महत्वपूर्ण लाभ पाते हैं. हम इन और उदाहरण, मानव bromodomain प्रोटीन BRD4, और histone deacetylase HDAC1 के रूप में दो महत्वपूर्ण epigenetic प्रोटीन का उपयोग प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोगिता प्रदर्शित करता है. ये उदाहरण उपन्यास बातचीत की खोज को सक्षम करने और eukaryotes में सेलुलर स्थानीयकरण निस्र्पक में इस तकनीक की शक्ति का प्रदर्शन है, जो मानव कार्यात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ आगे समझ.
सेलुलर समारोह, उत्तेजनाओं के जवाब, और विकास और / या रोग राज्यों में होने वाले परिवर्तनों को समझना जटिल इन विभिन्न गतिशील राज्यों 1,2 भर proteome के de-कनवल्शनफ़िल्टर्स से जुड़ा हुआ है. ज्यादा प्रोटीन की संख्या और सभी संभव बातचीत दिया, यह मानव proteome 1,3-7 के समाधान में बहुत चुनौतीपूर्ण हो गया है, हालांकि, कम जीवों के proteome को समझने के लिए किया गया है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री में अग्रिम बहुत इन अध्ययन करने की क्षमता के लिए सक्षम है, और यहाँ हम प्रोटीन परिसरों और स्तनधारी कोशिकाओं 8-10 से मानव प्रोटीन के कार्यात्मक विशेषता के दोनों कुशल पकड़ने के लिए HaloTag प्रौद्योगिकी के विकास के साथ एक अतिरिक्त और महत्वपूर्ण प्रगति प्रस्तुत करते हैं. यह तकनीक हाल ही में उपन्यास प्रोटीन समारोह और understandi में अंतर्दृष्टि की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण बातचीत की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो कई अध्ययनों में दिखाया गया हैरोग 11-13 के एनजी.
HaloTag प्रोटीन संलयन शुरू में परंपरागत आत्मीयता टैग और प्रोटीन पर कब्जा, शुद्धि, और लेबलिंग 8-10 के रूप में संबंधित एंटीबॉडी के कई चुनौतियों का सामना करने के लिए विकसित किया गया था. प्रोटीन पर कब्जा है और शोधन के लिए लगभग सभी तरीकों के भीतर, एक विशेष प्रोटीन 14 के संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है जो एक गैर सहसंयोजक बातचीत कदम है. इस चरण के दौरान, प्रोटीन और / या जटिल प्रक्रिया को पूरा करने के घंटे के बजाय मिनट की आवश्यकता है, खासकर अगर प्रसार की वजह से अलग कर सकते हैं. इस चिंता पते, संलयन प्रोटीन विशेष रूप से तेजी से और अचल कणों, सतहों, या fluorophores 9 या तो किया जा सकता है जो अपने ligands के साथ बातचीत करने के लिए इंजीनियर था. इसलिए यह अपने ligand के लिए बाध्य है एक बार, यह अन्य आत्मीयता टैग की तुलना में सबसे अधिक फर्क कारक में से एक है, जो बाध्य बनी हुई है. इसके अलावा यहां का प्रदर्शन, क्षमता हैligands 9 (चित्रा 1) बारी से संभव है, जो एक भी निर्माण के साथ विभिन्न जैविक सवालों का पता करने के लिए. उदाहरण के लिए, प्रोटीन बातचीत या समारोह से पूछताछ की, सतह ligands प्रोटीन या परिसरों का कब्जा (चित्रा 1) के लिए उपयोग किया जाता है. एक अलग प्रयोग में, एक ही संलयन प्रोटीन fluorescently सेलुलर स्थानीयकरण, तस्करी, या प्रोटीन कारोबार (चित्रा 1) के अध्ययन करने के लिए लेबल किया जा सकता. यह एक ligand यह अपरिवर्तनीय है, यह एक सतह या एक fluorophore है, चाहे वह स्वाभाविक है और इसलिए अन्य ligands तो बाद में ही प्रयोग में बाध्य नहीं किया जा सकता हालांकि कि एक बार याद करने के लिए महत्वपूर्ण है.
प्रोटीन बातचीत मैप करने के लिए मौजूदा प्रौद्योगिकियों के विश्लेषण कुशलता से अधिक क्षणिक हैं या कम बहुतायत 1,6,7,14,15 में हैं जो उन सहित विशेष बातचीत, अलग करने के लिए कठिनाई का पता चलता है. कई समूह द्वारा इसके अलावा, हाल ही में कामपारंपरिक अलगाव तरीकों के भीतर, विशेष रूप से मानव प्रोटिओमिक्स के क्षेत्र में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 16 में सच interactors से संकेत मुखौटा हो सकता है जो प्रोटीन contaminants की एक महत्वपूर्ण संख्या रहे हैं कि चिंता को दर्शाता है. HaloTag प्रोटीन और अच्छी तरह से अपनी सह विकसित राल पते इन चिंताओं के लिए विकसित गुण. में परिसरों के बंधन जटिल pulldowns के लिए प्रोटोकॉल (चित्रा 1), दोनों परिसर पर कब्जा को बढ़ावा देने और गैर विशिष्ट 8 बंधन के स्तर को कम करने, 15 मिनट में प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, अचल बाध्यकारी कम बहुतायत प्रोटीन के कुशल कब्जा करने के लिए अनुमति देता है और अब तक कम कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुमति देता है, फिर पृष्ठभूमि 8 को कम करने. परिसरों का कब्जा स्थापित हो जाने के बाद, प्रोटोकॉल जटिल अखंडता को बनाए रखने के लिए हल्के धोने शर्तें शामिल हैं. पर कब्जा कर लिया परिसरों की क्षालन विधि नीचे की ओर गुदा का लक्ष्य तय करती है जो दो तरीकों और चुनने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता हैysis. इच्छा विश्लेषण या पश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बातचीत प्रोटीन की खोज है, तो यह इस तरह एसडीएस या यूरिया (चित्रा 1) के रूप में denaturants साथ परिसरों elute की सिफारिश की है. यह मूल रूप से HaloTag के लिए जुड़े हुए प्रोटीन, चारा प्रोटीन करार के रूप में, राल के लिए बाध्य पीछे रहेगा और इसलिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री में पाया पेप्टाइड्स की आबादी पर हावी नहीं होगा मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है. यह भी चारा प्रोटीन की संभावना पश्चिमी धब्बा, अन्य गैर सहसंयोजक आत्मीयता purifications या सह immunoprecipitations की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर से विश्लेषण में दिखाई नहीं देगा हालांकि इसका मतलब है. लक्ष्य कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक जटिल बरकरार शुद्ध करने के लिए है, तो क्षालन संलयन प्रोटीन और चारा प्रोटीन (चित्रा 1) के बीच इनकोडिंग अपने आत्मीय दरार अनुक्रम जो पहचानता TEV (तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस) प्रोटीज, का उपयोग किया जा सकता है. टीhese नमूने भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन बाद में पता चला, वे कम बहुतायत का पता लगाने, विशिष्ट interactors रोक सकता है कि चारा प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल होंगे.
यहाँ हम दो महत्वपूर्ण चिकित्सा संबंधी प्रोटीन, bromodomain प्रोटीन BRD4 और एक histone deacetylase, HDAC1 17 के लिए लागू pulldown और इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. मास स्पेक्ट्रोमेट्री, HDAC1 के लिए जटिल अलगाव के बाद enzymatic गतिविधि, और दोनों के लिए उचित सेलुलर स्थानीयकरण द्वारा निर्धारित रूप में हम उम्मीद सहयोगियों के साथ इन उदाहरणों, बातचीत से पता चला है. साथ में, इन परिणामों यूकेरियोटिक प्रोटीन बातचीत और समारोह के लक्षण वर्णन के लिए प्रौद्योगिकी के multifunctional प्रकृति और ताकत का प्रदर्शन.
दो संलयन प्रोटीन, हेलो-BRD4 और हेलो-HDAC1, अभिव्यक्ति के लिए यूकेरियोटिक स्तनधारी कोशिकाओं में विशेषता, प्रोटीन जटिल अलगाव और गतिविधि, और सेलुलर स्थानीयकरण पर बातचीत. इन विभिन्न प्रोटोकॉल के माध्यम से काम करने में, प्रत्येक प्रयोग की सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. खुद को शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है टैग के किसी भी संलयन प्रोटीन, अभिव्यक्ति के स्तर और नियुक्ति के मामले में है. यह पूर्व ज्ञान या किसी अन्य टैग के साथ काम पसंद की विशेष प्रोटीन के लिए प्रदर्शन किया गया है नहीं तो एन और / या सी टर्मिनल fusions से डिजाइन करने की आवश्यकता होगी कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्तर बहुत अधिक है अगर अभिव्यक्ति के बारे में, डीएनए के कमजोर पड़ने उचित है कि स्तर को प्राप्त करने के लिए कमजोर प्रमोटरों के साथ वैक्टर के अभिकर्मक या प्रयोग के दौरान संभव हो रहे हैं प्रदर्शन किया जा सकता है. पिछला काम अंतर्जात Le में macromolecular परिसर के कुशल अलगाव दिखा प्रदर्शन किया गया हैअभिव्यक्ति की बहुत कम स्तर पर काम सक्रिय करने के अभिव्यक्ति 8 वी इ एल एस,. यदि संभव हो तो, सेलुलर स्थानीयकरण अध्ययनों से यह भी उचित शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक इष्टतम टैग प्लेसमेंट की स्थिति के साथ ही रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में जानकारी प्रदान करने में सक्षम हो जाएगा.
संलयन प्रोटीन सबसे बड़ा लाभ में से एक के रूप में जटिल अलगाव की गति है, यह बाध्यकारी, सेल में सिफारिश की समय फ्रेम का पालन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है प्रोटोकॉल, और वाशिंग वर्गों के साथ अधिकतम सफलता प्राप्त करने के लिए, पुलडाउन प्रयोगों के लिए तैयार हैं प्रक्रिया. इन कदमों से किसी भी समय में lengthened कर रहे हैं जैसे एक एंटीबॉडी आधारित कब्जा विधि के लिए आवश्यक है, एक जटिल विसंघटन का खतरा या 8 बाध्यकारी वृद्धि की गैर विशिष्ट है. टाइम्स सेलुलर सेल या बंधन के दौरान छोटा कर रहे हैं इसी तरह अगर, कोशिकाओं को पूरी तरह lysed या कुशलता क्रमशः कब्जा नहीं किया जा सकता है. Washes की संख्या decr है तोढील या राल का अच्छा मिश्रण बंधन या washes के दौरान उत्पन्न नहीं होती है, तो गैर विशिष्ट प्रोटीन की पृष्ठभूमि का स्तर बढ़ जाएगा. इसके अलावा, सेल के साधन राल के लिए बाध्य दक्षता के लिए संबंधित के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है. , नमूने sonicate सिफारिश डिटर्जेंट हटाने, एसडीएस या अन्य मजबूत डिटर्जेंट जोड़ने, और / या protease अवरोध AEBSF शामिल करने के प्रयास कम या राल के लिए संलयन प्रोटीन और उनके परिसरों के बंधन का नुकसान होगा.
स्तनधारी कोशिकाओं और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 16 से विश्लेषण में पृष्ठभूमि को कम करने की चुनौती के साथ मानव प्रोटिओमिक विश्लेषण संघर्ष से जटिल अलगाव के लिए मौजूदा तरीकों. इस contaminating प्रोटीन का भंडार कई मास स्पेक्ट्रोमेट्री समूहों 16 से बनाया गया है कि इतनी महत्वपूर्ण हो गया है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री pulldown नमूनों में पृष्ठभूमि की पहचान रोकता है जो कुछ भी रूप में परिभाषित किया जा सकता हैचारा प्रोटीन का सच interactors. जैसे, पृष्ठभूमि गैर विशिष्ट प्रोटीन या भी चारा प्रोटीन या चारा प्रोटीन वेग के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के बड़े सांद्रता contaminating से पैदा कर सकते हैं. महत्वपूर्ण कार्य यहाँ प्रस्तुत pulldown प्रोटोकॉल के साथ ही pulldown प्रक्रिया में गैर विशिष्ट contaminating प्रोटीन का स्तर कम करने के लिए राल दोनों के अनुकूलन में किया गया था. यह चांदी दाग जैल और नियंत्रण के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (चित्रा 2) में स्पष्ट है. चारा प्रोटीन या अन्य तरीके से संघर्ष के साथ जो contaminants और के रूप में समान रूप से हानिकारक हो सकता है कि एंटीबॉडी के उच्च स्तर का पता, एसडीएस क्षालन साथ pulldown (प्रोटोकॉल धारा 2.4) की सिफारिश की है. कारण राल को सहसंयोजक लगाव को, इस प्रक्रिया covalently राल से जुड़ी प्रारंभिक संलयन प्रोटीन का बहुमत छोड़ देंगे. चारा का एक छोटा सा प्रतिशत माना जाता है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में मनाया जाता हैहाइड्रोलिसिस के माध्यम से होती है, लेकिन यह अन्य कमजोर या क्षणिक बातचीत 8 का पता लगाने के लिए एक समस्या मौजूद नहीं है.
शुरूआत में उल्लेख किया है, प्रोटिओमिक्स में उल्लेखनीय प्रगति मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,7 में महत्वपूर्ण प्रगति से सक्षम किया गया है. इसलिए, यह pulldowns में प्राप्त प्रोटीन का मिश्रण deconvolute मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के चुनाव की महत्वपूर्ण मापदंडों को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है. इंस्ट्रुमेंटेशन मजबूत और नियमित रूप से और कुशलता <1 ग्राम से अक्सर कम प्रोटीन की एक छोटी राशि है, जिसमें नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए. 100-300 NL / मिनट रेंज में प्रवाह की दर के साथ 50-75 माइक्रोन आंतरिक व्यास HPLC कॉलम शामिल नेनो पैमाने क्रोमैटोग्राफी आम तौर पर छोटा सा नमूना आकार के साथ संगतता के लिए कार्यरत है और मास स्पेक्ट्रोमीटर की संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए. एक विश्लेषण के राज्य ओ में प्राप्त जानकारी को अधिकतम करने के लिएच aforementioned nanoscale के विभाजन के साथ संगत एक समय के पैमाने, ≥ 10 हर्ट्ज पर उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने में सक्षम कला मास स्पेक्ट्रोमीटर, आम तौर पर कार्यरत हैं. इन उपकरणों संवेदनशीलता का attomolar स्तर है और नियमित रूप से उप पीपीएम अग्रदूत और उत्पाद आयन जन त्रुटि tolerances के साथ डेटा प्राप्त कर सकते हैं. ये प्रदर्शन विशेषताओं पहचान प्रोटीन की संख्या की उपज और उन पहचान के साथ जुड़े आत्मविश्वास को बढ़ाने के लिए काम करते हैं.
उपन्यास बातचीत की खोज के लिए क्षमता के साथ प्रोटीन बातचीत, और सभी एक ही निर्माण का उपयोग कर सक्रिय परिसरों का अलगाव: इन आंकड़ों के साथ हम शारीरिक सेलुलर स्थानीयकरण, उचित प्रोटीन प्रदर्शित करता है. दरअसल वैकल्पिक तकनीकों लेकिन संभावना नहीं सभी 23,24 के लिए, इन विभिन्न पहलुओं में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HaloTag तकनीक के साथ, एक multifunctional दृष्टिकोण proteom बढ़ते इस्तेमाल किया जा सकता हैआईसीएस पढ़ाई और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन समारोह की एक और पूरी समझ प्राप्त करने.
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. मार्टिन रोसेनबर्ग, डॉ. गैरी Tarpley, और डॉ. कीथ लकड़ी इस काम का समर्थन करने के लिए, और डॉ. जेम्स कैली धन्यवाद. DLD, जेएम, एचबी, समुद्री मील दूर, एक, जे.सी., और म्यू Promega निगम के कर्मचारी हैं. म्यूचुअल फंड, आरजे, आर ए, और डीए एमएस Bioworks, एलएलसी के कर्मचारी हैं.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |