Electrospun Fibrer Byggnadsställningar av poly (glycerol-dodecanedioate) för Engineering neurala vävnader från mus embryonala stamceller
Summary
Syntes och tillverkning av elektrospunna långa fibrer som spänner över en större insättning området via en nydesignad samlare från en ny biologiskt nedbrytbar polymer som heter poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) rapporterades. Fibrerna kunde understödja tillväxten av celler härledda från mus pluripotenta stamceller.
Abstract
För vävnadstekniska tillämpningar, är framställningen av biologiskt nedbrytbara och biokompatibla byggnadsställningar den mest önskvärda men utmanande uppgift. Bland de olika tillverkningsmetoder, är electro den mest attraktiva en på grund av dess enkelhet och mångsidighet. Dessutom elektrospunna Nanofiber likna storleken på naturliga extracellulärmatrix säkerställa ytterligare stöd för cellöverlevnad och tillväxt. Denna studie visade att lönsamheten för tillverkning av långa fibrer som spänner över en större insättning område för en ny biologiskt nedbrytbar och biokompatibla polymer som heter poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) 1 med hjälp av en nyutvecklad uppsamlare för electro. PGD uppvisar unika elastiska egenskaper med liknande mekaniska egenskaper till nervvävnader, därför är det lämpligt för neurala vävnadstekniska tillämpningar. Det syntes och tillverkning set-up för att göra fiberställningsmaterial var enkel, mycket reproducerbar, och billig. I biokompatibilitettestning, celler från mus embryonala stamceller skulle kunna ansluta sig till och växa på elektrospunna PGD fibrerna. Sammanfattningsvis detta protokoll som en mångsidig tillverkningsmetod för att göra PGD elektrospunna fibrer för att stödja tillväxten av musen embryonala stamceller härledda neurala härstamning celler.
Introduction
Electro är en av de effektiva bearbetningsmetoder för att producera mikro till-nanometerstorlek fiber ställningar. Den grundläggande principen för electro involverar en Taylor-konen av lösning som hålles vid mynningen av en nål genom att applicera hög spänning mellan nålspetsen och en jordad kollektor. När den elektrostatiska repulsionen i lösningen övervinner ytspänningen är en laddad vätskestråle sprutas ut ur kanylspetsen, färdas genom luften med lösningsmedelsindunstning, och slutligen deponeras på jordad kollektor. Sprutpumpen tillhandahåller ett kontinuerligt flöde av lösningen som kommer ut från spinndysan och sålunda multipla kopior av elektrospunna fibrer kan tillverkas inom en kort tidsperiod. Under lämnar munstycket för att komma fram till samlare, kommer den laddade jet genomgå stretching och piska enligt ett antal parametrar som inkluderar viskositeten och ytspänningen av polymerlösningen, de electrostatic kraft i lösning, och interaktionen av den yttre elektriskt fält, etc. 2.
I electro och tjänar en samlare som en ledande substrat där mikro-till-nanometer fibrer kan deponeras. I denna studie var en ny typ av fibersamlare som syftar till att få fibermattor med önskad storlek (längd x bredd). Traditionellt är aluminiumfolie som används som en kollektor, men det är svårt att överföra fibrerna från den plana ytan till ett annat substrat. Svårigheten att skörda en intakt fibermatta från en traditionell samlare beror främst på det faktum att elektrospunna fibrerna fäster starkt till samlare yta. Därför modifierades vi kollektorn genom vikning av en bit aluminiumfolie i en rektangulär remsa och kopplar den vinkelrätt mot en plan metallplatta. De elektrospunna fibrerna sträcks över området mellan spetsen av remsan och metallplattan, som lätt kan överföras till en annan Substrate.
Intresset för termiskt tvärbundna elastpolymerer växer snabbt på grund av det banbrytande arbetet av Robert Langers grupp, som introducerade poly (glycerol sebacat) (PGS), en polyester som är analog med vulkaniserat gummi 2002 3. Liknar PGS, har vi framgångsrikt utvecklat poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) genom termisk kondensation av glycerol och dodekandioinsyra och visat sin unika form minne egendom 1. Till skillnad styvare syntetmaterial poly (hydroxyl-butyrat) eller poly (L-laktid) (elasticitetsmodul av 250 MPa och 660 MPa, respektive), uppvisar PGD elastomera egenskapen som gummi, med en Youngs modul av 1,08 MPa när temperaturen är över 37 ° C, vilket är en nära matchning till in situ perifer nerv (0,45 MPa). Dessutom är PGD bionedbrytbara och nedbrytningstiden kan finjusteras genom att variera förhållandet av glycerol och dodekandisyra. Dodekandisyra är en tolv-kol-subhållning med två terminala karboxylgrupper, HOOC (CH 2) 10 COOH. Även numrerade dikarboxylsyror såsom sebacinsyra och dodekandisyra kan metaboliseras till acetyl-CoA och ange trikarboxylsyra (TCA) / (citronsyra) cykel. Den metabola produkten enligt dikarboxylsyror, succinyl-CoA, är en gluconeogenetic prekursorn och intermediär med TCA-cykeln 4. Sålunda föreslog vissa studier att de skulle kunna användas som ett alternativt bränsle substrat för enteral och parenteral näringstillförsel, särskilt i de patologiska tillstånden. Dessutom uppvisar PGD unik formminne därför att dess glasövergångstemperatur är 31 ° C, vilket visar det distinkta mekaniska egenskaper vid rumstemperatur och vid kroppstemperatur. Sammanfattningsvis är PGD biologiskt nedbrytbar, biokompatibla, uppvisar unika elastiska egenskaper med mekaniska egenskaper som liknar nervvävnader; därför är det ett lämpligt material för nervvävnad tekniska tillämpningar. I detta protokoll, den electrospunlånga fibrer som spänner över en stor insättning område tillverkades via nydesignade samlare från PGD. Fiber ställningar kan stödja mus pluripotenta stamceller tillväxt och differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begränsningarna av enkla samlare eller komplexiteten av roterande samlare som för närvarande används för electro öka begränsningen att få önskad längd och storlek på fibermatta för vissa tillämpningar. Dessutom överför fibrer från markkollektorn till odlingsskålen eller andra substrat är en utmaning 5. I denna rapport, en nydesignad samlare, gjorde helt enkelt genom att fästa en aluminiumfolie band till den jordade samlare, kunde få stora storlek fibermattor upp till 10 cm med 20 cm i tage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete genomfördes med hjälp av faciliteterna på Biomedical Engineering Department vid Florida International University.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly (ehtylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -. C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -. J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -. Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
