Summary
Síntese e fabricação de fibras longas electrospun abrangendo uma área maior depósito através de um coletor recém-concebido a partir de um polímero biodegradável romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) foi relatado. As fibras eram capazes de suportar o crescimento de células derivadas de células-tronco pluripotentes.
Abstract
Para aplicações de engenharia de tecidos, a preparação de scaffolds biodegradáveis e biocompatíveis é a tarefa mais desejável, mas desafiador. Entre os vários métodos de fabricação, electrospinning é o mais atractivo, devido à sua simplicidade e versatilidade. Além disso, nanofibras electrospun imitar o tamanho da matriz extracelular natural, assegurando um apoio adicional para a sobrevivência e crescimento das células. Este estudo mostrou a viabilidade da fabricação de fibras longas, abrangendo uma área maior depósito de um polímero biodegradável e biocompatível romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) 1, usando um coletor recém-projetado para electrospinning. PGD exibe propriedades elásticas originais com propriedades mecânicas semelhantes às dos tecidos nervosos, assim, ele é adequado para aplicações de engenharia de tecidos neurais. A síntese e fabricação set-up para fazer materiais fibrosos andaimes era simples, altamente reprodutível e barato. Em biocompatibilidadeteste, as células derivadas de células estaminais embrionárias de ratinho podia aderir e crescer nas fibras PGD electrospun. Em resumo, este protocolo fornecido um método de fabricação versátil para fabricação de fibras PGD electrospun para suportar o crescimento de células da linhagem neurais derivadas do rato de células-tronco embrionárias.
Introduction
Eletrofiação é um dos métodos de processamento eficazes para produzir suportes de fibra de tamanho micro-a-nanómetro. O princípio básico de electrospinning envolve um cone de Taylor de uma solução que é realizada ao nível do orifício de uma agulha através da aplicação de alta tensão entre a ponta da agulha e de um colector ligado à terra. Quando a repulsão electrostática na solução vence a tensão superficial, um jacto de fluido carregado é ejectado para fora da ponta da agulha, se desloca através do ar com a evaporação do solvente, e é, finalmente depositada sobre o colector ligado à terra. A bomba de seringa fornece um fluxo contínuo de uma solução que emerge da fieira e, portanto, múltiplas cópias das fibras electrospun pode ser fabricado dentro de um curto período de tempo. Durante o curso de deixar a fieira de chegar ao colector, o jacto carregada sofrer estiramento e batimento de acordo com uma série de parâmetros, que incluem a viscosidade e tensão superficial da solução polimérica, os electrostatic força na solução, ea interação do campo elétrico externo, etc 2.
No processo de electrospinning, um colector serve como um substrato condutor em que as fibras de micro-a-nanométrica pode ser depositado. Neste estudo, um novo tipo de colector de fibras foi concebido para obter mantas de fibra com a dimensão desejada (comprimento x largura). Tradicionalmente, a folha de alumínio é usado como um colector, mas é difícil de transferir as fibras a partir da superfície plana a um outro substrato. A dificuldade de colher um tapete de fibra intacta de um colecionador tradicional deveu-se principalmente ao fato de que as fibras electrospun anexar fortemente à superfície do coletor. Portanto, nós modificamos o coletor dobrando um pedaço de papel alumínio em uma tira retangular e anexá-lo perpendicular a uma placa de metal plana. As fibras são electrospun esticado em toda a área entre a ponta da tira e a placa de metal, que pode ser facilmente transferida para outro substrate.
Interesse em polímeros elastoméricos termicamente reticuladas está crescendo rapidamente por causa do trabalho pioneiro do grupo de Robert Langer, que introduziu poli (sebaçato glicerol) (PGS), um poliéster que é análoga à borracha vulcanizada, em 2002 3. Semelhante ao PGS, temos desenvolvido com sucesso poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) por condensação térmica do glicerol e ácido dodecanodioíco e demonstrou a sua propriedade única memória de forma 1. Ao contrário rígida poli materiais sintéticos (hidroxil-butirato) ou poli (L-lactido) (módulos de Young de 250 MPa e 660 MPa, respectivamente), o PGD exibe propriedade elastomérica como a borracha, com um módulo de Young de 1,08 MPa, quando a temperatura estiver acima de 37 ° C, que é um jogo perto do nervo periférico in-situ (0,45 MPa). Além disso, o PGD é biodegradável e o tempo de degradação, podem ser afinadas variando a proporção de glicerol e ácido dodecanóico. Ácido dodecanodioíco é um sub de doze carbonoposição com dois grupos carboxílicos terminais, HOOC (CH2) 10 COOH. Ácidos dicarboxílicos pares numeradas como ácido sebácico e o ácido dodecanodióico pode ser metabolizado a acetil-CoA e introduzir o ácido tricarboxílico (TCA) / ciclo (ácido cítrico). O produto metabólico de ácidos dicarboxílicos, succinil-CoA, é um precursor gluconeogenetic e intermédia do ciclo de TCA 4. Assim, alguns estudos sugerem que poderiam ser utilizados como um substrato de combustível alternativo para nutrição entérica e parentérica, especialmente nas condições patológicas. Além disso, o PGD exibe memória de forma única por causa da sua temperatura de transição de vidro é de 31 ° C, portanto, apresenta propriedades mecânicas diferentes, à temperatura ambiente e à temperatura do corpo. Em suma, a PGD é biodegradável, biocompatível, exibindo propriedades elásticas únicas com propriedades mecânicas semelhantes aos tecidos nervosos; por conseguinte, é um material adequado para aplicações de engenharia de tecidos nervosos. Neste protocolo, o electrospunfibras longas que abrangem uma grande área de depósito foram fabricados através do coletor recém-projetado do PGD. Os andaimes de fibras pode suportar o crescimento e diferenciação de células-tronco pluripotentes.
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Protocol
1. Setup Electrospinning Collector
- Corte o papel alumínio em uma peça retangular.
- Dobre o pedaço retangular em uma tira retangular, e anexá-lo perpendicular a uma placa de metal plana com fita adesiva (Figura 1). Nota: O tamanho da esteira de fibras dependem do comprimento e da largura da tira. Assim, as dimensões da tira pode ser ajustada conforme necessário.
2. Solução polimérica Preparação
- Mistura de glicerol e ácido dodecanóico (ADD) em razão molar de 1:1, num copo de 120 ° C durante 100 horas para se obter polímero de DGP.
- Dissolve-se o poli (óxido de etileno) (PEO) e de gelatina, em etanol a 65% com uma proporção de peso de 1.5:3:95.5 em um tubo de 15 ml, apertar a tampa e aquecer a mistura num forno a 60 ° C durante 1 hora com agitação até que se torna uma solução homogénea (solução basal).
- Para electrospinning, misture o polímero PGD ea solução basal em 04:06 de peso. Nota: concentração PGD tem um big efeito sobre o diâmetro da fibra. 30% -50% por cento PGD é aceitável para a produção de fibras mais do que 5 cm com diâmetros de fibra de aumento.
- Adicionar 0,1% de riboflavina para a solução polimérica e misturar bem.
3. Electrospinning
- Alimente a solução polimérica em uma seringa de 5 ml de série com um 18 G embotada agulha de aço inoxidável.
- Insira a seringa em uma bomba de seringa.
- Ligue o cabo ligado à terra de uma fonte de alimentação de alta tensão para a placa de metal e o chumbo carregada positivamente para a agulha.
- Ajustar a distância entre a agulha e a tira de folha de alumínio de 15 cm.
- Coloque a bomba de seringa em um ângulo de aproximadamente 15 ° com a horizontal para impedir a agregação das fibras na parte da frente da faixa.
- Ligar a bomba de seringa e ajustar a taxa de fluxo da bomba de 0,6 mL / hora.
- Ligue a fonte de alimentação de alta tensão e ajustar a tensão de operação de 14,6 kV.
4.Processamento de fibras
- Após a recolha está completa, expor a esteira de fibra para a luz UV, durante 60 minutos para a ligação cruzada.
- Transferir a esteira de fibras a partir da tira de folha de alumínio de uma placa de Petri de 100 milímetros, e expô-la à luz UV durante mais 20 min para a esterilização.
- Em uma cabine de segurança biológica, cortar a manta de fibra em peças redondas do mesmo tamanho com uma lâmina de bisturi e colocar os pedaços em uma placa de 24 poços.
- Para o tratamento das células de pré-sementeira, imergir amostras de fibras em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) e incuba-se a 37 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, cuidadosamente aspirado PBS, adicionar 1 ml de meio de diferenciação (DMEM/F12, N2, e FGF2) (ver receita na tabela Materiais) a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 3 hr.
- Meio de diferenciação aspirado cuidadosamente, adicionar 0,2 mL de matrigel a cada amostra de fibra e incubar a 37 ° C durante 30 min. Nota: A laminina também pode ser utilizado para o revestimento de fibra. Adicionar 0,2 mL de 20 ug / ml de lamininapara a fibra e incubar à temperatura ambiente durante 3 hr.
- Com cuidado, retire o excesso de matrigel de cada poço. Lavar com 2 ml de meio de diferenciação de uma vez. Nota: As amostras de fibras estão prontos para a cultura de células.
5. Sementeira celular em Fibras
- Adicionar 1 ml de Accutase para o prato de cultura de células MES e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Após 10 min, as células MES são separadas do prato de cultura. Adicionar 4 ml de meio de diferenciação para a placa. Recolher as células MES flutuantes em um tubo de 15 ml e as células para cima e para baixo de pipeta para quebrar colónias (cerca de 15x).
- Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos e re-suspender as células em 4 ml de meio de diferenciação.
- Contar as células usando um hemocitômetro. Transferir 200 ul da suspensão de células para um tubo de 15 ml e diluir 10x com meio de diferenciação. Transferir 15 uL da suspensão de células diluída a uma câmara na hemocitómetro com uma lamela no lugar. Contaras células no quadrado do centro a 1 mm e as quatro esquinas do hemocitómetro sob o microscópio. Nota: celular por ml = a contagem média por metro quadrado x fator de diluição x 10 4
- Colocar aproximadamente 5 x 10 4 células MES em cada poço. Gota lentamente a suspensão de células para o meio das amostras de fibras, em vez de correr para fora do lado do poço, para evitar que a solução de se drenar o tapete de fibra.
- Adicionar 1 ml de meio de diferenciação em cada poço, e manter a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células de fixação, o crescimento e diferenciação.
- Aspirar o meio antigo em cada poço e substitua com 1 ml de meio de diferenciação fresco todos os dias.
6. Viabilidade celular
- Aspirar o meio antigo em cada poço.
- Misture 1/10 de volume de Resazurina reagente de fluorescência com o meio de cultura e adicionar 1 ml para cada poço.
- IncubComeram a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4 h, protegido da luz directa.
- Depois de 4 horas, transferir 100 mL 3x do reagente de cada poço de uma placa de 96 poços, em seguida, as amostras estão prontas para ser medido em um espectrofotômetro de fluorescência usando configurações de filtro de 560EX nm/590EM.
7. PCR em Tempo Real
- Após 14 dias de cultura, adicionar tampão de lise às amostras e isolar o RNA total a partir das células nas amostras de fibras.
- Use 4 ul de ARN total, para sintetizar ADNc em 20 uL de escalas de reacção de transcrição reversa.
- Preparar a mistura de reacção de PCR em cada um dos tubos óptica: 10 ul Master Mix (2x), 0,2 ul de corante, 8 mL de água livre de nuclease, 1 ul de cDNA, e um iniciador pi (iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1).
- Configure o programa de PCR: a. 95 ° C 02:20 min, um ciclo de b. 95 ° C 3 seg → 60 ° C 1 min, 40 ciclo c. 95 ° C 15 seg, um ciclo d. 60 ° C 1min, um ciclo de e. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo. Escolha forma de C T comparativo para determinar os níveis de expressão gênica relativa.
- Após PCR for concluído, analisar os resultados em tempo real PCR com software StepOne e exportar os resultados para o Excel.
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Representative Results
Os principais componentes do electrospinning são mostrados na Figura 1. Uma esteira de fibras de tamanho grande foi tipicamente obtida através da tira perpendicularmente ligada folha de alumínio e uma chapa de metal plana. Figura 2 mostra o desenho do colector e o tapete de fibra de electrospinning. A largura e o comprimento pode ser ajustado para diferentes aplicações. O comprimento da fibra feito com polímeros de PGD e mistura solução basal é de até 10 cm. A morfologia das fibras electrospun é mostrado na Figura 3. Os diâmetros das fibras feitas a partir de 40% de concentração de PGD são em escala micrométrica. As imagens de microscopia confocal de células diferenciadas derivadas de MES células cultivadas durante 3 a 6 dias em fibras estão representados na Figura 4. Os sinais fluorescentes verdes veio da expressão excessiva de proteína fluorescente verde (GFP) em células. O resultado da Resazurina reagente fluorescência na Figura 5 mostrou que as células crescem MESn no revestimento de fibras de PGD com matrigel e laminina tinha viabilidade celular equivalente e tinha proliferação relativamente mais elevada em comparação com o grupo não revestido. A expressão do gene de pluripotência e células neurais marcadores foi quantificada por PCR em tempo real (Figura 6). A maioria das células cultivadas em MES fibras expressa o OCT4 marcadores de pluripotência, Nanog e Sox2 enquanto a minoria de células expressa a célula estaminal neural marca PAX6 e nestina. Após 2 semanas de cultura, crescidas em MES fibras mostraram níveis aumentados de expressão de marcas de células neuronais, tais como MAP2 e DCX, bem como marcador de oligodendrócitos Oligo1 e marcador de astrócitos GFAP.
Figura 1. Electrospinning configurar. A solução polimérica é ejetada de uma agulha embotada. Motivos uma fonte de energia de alta tensão de um metal plana placa umnd uma tira de folha de alumínio, entre os quais as fibras metro micro-a-nano são depositados (azul).
Figura 2 desenho. Collector e um tapete de fibra electrospun. A largura e comprimento da esteira de fibras pode ser facilmente alterada por ajustamento do tamanho da tira de folha de alumínio. Não existe um limite para a largura da esteira, e as fibras mais compridas pode ser de até 10 cm de comprimento.
Figura 3. Imagens SEM de electrospun de PGD e solução basal 4:06 (w / w). O diâmetro médio das fibras é de cerca de 2 mm. Quando a concentração de PGD diminui para 30%, o diâmetro médio das fibras cai em escala nanométrica. O brancobarra de escala representa 10 mM.
Figura 4. Imagens de microscopia confocal de células MES diferenciadas em fibras. As células que transportam o GFP apresentam fluorescência verde brilhante quando exposta à luz em azul à faixa ultravioleta. O aumento do número de células verdes fluorescentes no dia 6 indica que os suportes de fibra pode suportar a adesão e proliferação de células. A barra de escala branco representa 100 mm. (Dia 3 eo dia 6).
Figura 5. A viabilidade celular das células MES em fibras PGD revestimento com Matrigel e laminina em 1, 3 e 5 dias, conforme determinado por resazurina fluorereagente scence. células cultivadas sobre as fibras sem revestimento utilizados como controlo (p <0,05).
Figura 6. Análise de qRT-PCR da expressão do gene em células MES diferenciadas nas fibras PGD. Os marcadores de células neuronais evidentes após 2 semanas demonstraram que as células MES nos andaimes foram diferenciadas em células neurais.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
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Discussion
As limitações de coletores simples ou as complexidades de colecionadores que são usados atualmente para eletrofiação aumentar a restrição de se obter o comprimento desejado e tamanho do tapete de fibra para algumas aplicações rotativas. Além disso, a transferência de fibras do coletor de terra para o prato de cultura ou outros substratos é um desafio 5. Neste relatório, um coletor recém-concebido, feito, simplesmente anexando uma tira de folha de alumínio para o coletor de castigo, foi capaz de obter grandes esteiras de fibra de tamanho até 10 cm por 20 cm em cada vez. Figuras 1 e 2 ilustram a configuração esquemática projetado para a fabricação de até 10 cm de fibras electrospun longas com largura mat controlada. Influenciado pelo campo eletrostático entre a ponta da agulha e coletor, as fibras electrospun foram esticados em toda a área entre a faixa de folha de alumínio e coletor de terra para formar um tapete de fibra suave, que pode ser facilmente transferidos para outro substrate. Fibras electrospun fornecer estruturas fibrosas porosas que permitem às células para preencher e anexar a várias fibras em um ambiente verdadeiramente tridimensional. As esteiras de fibras gerados no presente estudo são grandes o suficiente para torná-los candidatos ideais para uma ampla gama de aplicações, tais como a cicatrização de feridas e regeneração neural.
Diâmetro das fibras pode ser ajustada controlando várias variáveis do processo de electrospinning. Estas variáveis incluem a concentração de polímero, a magnitude da tensão aplicada, a taxa de entrega de polímero, a distância a partir da agulha, para o colector, etc 6-8. Neste estudo, as soluções de teste, que foram compostos com 50% e 50% de PGD BS, 40% e 60% de PGD BS, 30% e 70% de PGD BS, e 20% de PGD e 80% de BS, respectivamente, foram preparadas para fazer fibras electrospun. Os andaimes fibrosas foram examinados usando SEM para determinar os diâmetros e as morfologias das fibras (Figura 3). Como esperado, as concentrações mais elevadas de PGD produced diâmetros maiores de fibras electrospun. Além disso, é essencial para ajustar o comprimento da tira de acordo com as diferentes concentrações de PGD. A concentração mais baixa PGD requer um comprimento mais curto tira para assegurar a formação de fibras.
Foram feitos inúmeros esforços para explorar a biocompatibilidade dos andaimes fibrosos electrospun através do estudo da cultura de células 9-13. As imagens de microscopia confocal na Figura 4 mostram que as células unidas com as fortes sinais fluorescentes verdes indicavam a sobrevivência celular em fibras PGD. Além disso, o aumento da densidade celular a partir do dia 3 ao dia 6 também sugeriu a proliferação celular em fibras PGD. O teste de viabilidade celular na figura 5 também confirmou este resultado. A expressão de genes de células neurais marcas MAP2 e DCX demonstrado que as células MES foram capazes de se diferenciarem em células neuronais nos andaimes (Figura 6). Em conclusão, o PGD andaimes fibrosos poderia apoiar adhesio celularn e proliferação, e, assim, apresentam potencial para aplicações de engenharia de tecidos neurais.
Aqui estão algumas diretrizes gerais de solução de problemas: se a fibra que sai da agulha é descontínua, aquecer a solução polimérica novamente e misture bem, ou se a fibra está aderindo à tira de folha de alumínio com nenhuma atração para a placa de metal, reduzir a faixa comprimento, ou aumentar a concentração de DGP. Às vezes, globs de polímeros grandes formam na ponta da agulha, desligue a fonte de alimentação de alta tensão, limpe-a com uma toalha de papel e reduzir a taxa de entrega da bomba. Além disso, às vezes, fibras agregadas sobre a aresta superior da tira de folha de alumínio tentar ajustar o ângulo da bomba de seringa.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado utilizando as instalações do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Internacional da Flórida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R.
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
