Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre
Summary
Abstract
Células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen un gran potencial para el estudio de desarrollo embrionario humano, para el modelado de enfermedades humanas en el plato y como una fuente de células trasplantables para aplicaciones de regeneración después de la enfermedad o accidentes. Células de la cresta neural (NC) son los precursores para una gran variedad de células somáticas adultas, tales como células del sistema nervioso periférico y glía, melanocitos y células mesenquimales. Ellos son una valiosa fuente de células para estudiar aspectos del desarrollo embrionario humano, incluida la especificación del destino celular y la migración. Además diferenciación de las células progenitoras NC en tipos de células diferenciadas terminalmente ofrece la posibilidad de modelar enfermedades humanas in vitro, investigar mecanismos de la enfermedad y generar células para la medicina regenerativa. En este artículo se presenta la adaptación de un protocolo vitro disponibles actualmente en la diferenciación para la derivación de células NC desde hPSCs. Este nuevo protocolo requiere 18 días de diferenciación, es-alimentador libre, fácilmente escalable y altamente reproducible entre células madre embrionarias humanas (hESC) líneas, así como células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas. Ambos viejos y nuevos protocolos producen células NC de igual identidad.
Introduction
Las células madre embrionarias (células madre) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) han demostrado un enorme potencial, en particular para la investigación y el tratamiento futuro de enfermedades humanas para las que están disponibles ni los buenos modelos animales ni los tejidos primarios. Ejemplos de aplicación de la tecnología de células madre / hiPSC son los siguientes: Las células de especial interés pueden ser generados a partir de células madre / hiPSCs para la medicina regenerativa en cantidad ilimitada 1. Las células pueden producirse a partir de pacientes portadores de una enfermedad específica y se utiliza para establecer en modelos de enfermedad in vitro 2,3. Tales modelos de enfermedad pueden ser empleados para la detección de drogas a gran escala en la búsqueda de nuevos compuestos farmacológicos 4, así como las pruebas de los medicamentos existentes para la eficacia y la toxicidad 5. Modelos in vitro de enfermedades pueden conducir a la identificación de los mecanismos de las enfermedades nuevas. Para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC es importante trabajar con específica, bien definirtipos d células afectadas en la enfermedad de interés. Por lo tanto, la disponibilidad de protocolos de diferenciación in vitro sólidas y reproducibles en es crucial para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / hiPSC. Los protocolos son deseables que muestran una variabilidad mínima, gasto de tiempo, esfuerzo, dificultad y costo, así como la reproducibilidad máxima entre las líneas de células madre / hiPSC y diferentes investigadores.
Las células de la cresta neural (NC) emergen durante neurulation vertebrados entre la epidermis y el epitelio neural. Ellos proliferan y migran ampliamente en todo el embrión en desarrollo y dan lugar a una impresionante diversidad de tipos de células progenie, incluyendo el hueso / cartílago, el esqueleto craneofacial, los nervios sensoriales, las células de Schwann, melanocitos, células de músculo liso, las neuronas entéricas, las neuronas autónomas, células cromafines , células cardiacas tabique, los dientes y las células glandulares suprarrenal / tiroideas 6. Por lo tanto, las células NC son un tipo de célula atractivo para el campo de células madre e importante para lamodelización de una variedad de enfermedades, como la enfermedad de Hirschsprung 7, disautonomía familiar 8, así como cánceres tales como el neuroblastoma 9. Además, ofrecen la posibilidad de estudiar los aspectos del desarrollo embrionario humano in vitro.
El actualmente disponibles y ampliamente aplicado en protocolo de diferenciación in vitro para la derivación de células NC de hESCs 10,11 requiere hasta 35 días de diferenciación y que implica la inducción neural en células alimentadoras tales como células del estroma MS5 y por lo tanto se lleva a cabo bajo condiciones de mal definidos. Si bien puede ser en mayor escala para generar grandes cantidades de células NC, por ejemplo se requiere para la detección de drogas de alto rendimiento 4, se trata de mano de obra y costos de obra. Además, se trata de pases manual de las rosetas de los nervios, que pueden ser difíciles de reproducir y por lo tanto está sujeta a la variabilidad general, en particular cuando se aplica a una gran variedad de células madre o hiPSClíneas. Aquí, se muestra la derivación gradual de células NC en un protocolo de 18 días que está libre de células alimentadoras. Este método es más corto y más definido que el protocolo utilizado actualmente. Además, es muy robusto en la generación de células NC entre diferentes líneas hiPSC. Es importante destacar que se ha demostrado que las células NC producidas por ambos protocolos surgen en la frontera de los rosetones de los nervios (en lo sucesivo denominado roseta-NC o R-NC). Las células derivadas utilizando cualquiera de los dos protocolos parecen morfológicamente idénticas, expresan los mismos marcadores NC y se agrupan en el análisis de microarrays. NC células derivadas usando el nuevo protocolo (R-NC) son funcionales, similar a las células derivadas NC usando el protocolo antiguo (MS5-R-NC) tal que pueden migrar y diferenciarse en neuronas más. Por lo tanto, las células se pueden utilizar simultáneamente con las células MS5-R-NC. El protocolo de células R-NC para la derivación de células NC de células madre / IPSC será útil para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC que implica el linaje NC. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Para la diferenciación de las células exitosa R-NC de células madre / hiPSCs deben hacerse las siguientes consideraciones. Es fundamental trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. En particular, es importante para poner a prueba las culturas HPSC para contaminación por micoplasma regularmente, ya que esto impedirá la contaminación diferenciación exitosa, pero no puede fácilmente ser detectado visualmente en cultivos de HPSC. La diferenciación R-NC debe iniciarse con la densidad celular 90-1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca para investigadores avanzados de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por medio de donaciones de NYSTEM (C026446; C026447) y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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