Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen
Summary
Abstract
Menschen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben ein großes Potenzial für die Untersuchung menschlichen embryonalen Entwicklung, für die Modellierung menschlichen Krankheiten in die Schüssel und als eine Quelle von transplantierbaren Zellen für regenerative Anwendungen nach der Krankheit oder Unfälle. Neuralleiste (NC)-Zellen sind die Vorläufer für eine Vielzahl von adulten somatischen Zellen, wie Zellen des peripheren Nervensystems und Glia, Melanozyten und mesenchymalen Zellen. Sie sind eine wertvolle Quelle der Zellen, um Aspekte der menschlichen embryonalen Entwicklung, einschließlich Zellschicksal Spezifikation und Migration zu untersuchen. Eine weitere Differenzierung der NC-Vorläuferzellen in terminal differenzierten Zelltypen bietet die Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren in vitro untersuchen Krankheitsmechanismen und erzeugen Zellen für die regenerative Medizin. Dieser Artikel stellt die Anpassung eines derzeit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs. Dieses neue Protokoll erfordert 18 Tagen unterschiedrentiation ist Feeder-frei, einfach skalierbare und hoch reproduzierbare unter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Linien sowie menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. Beide alten und neuen Protokolle ergeben NC-Zellen gleicher Identität.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben immense Potenzial gezeigt, insbesondere für die Untersuchung und die künftige Behandlung von Krankheiten des Menschen, für die weder gut noch Tiermodellen primären Gewebe zur Verfügung. Anwendungsbeispiele für den HES / hiPSC Technologie sind die folgenden: Zellen von besonderem Interesse kann von hESC / hiPSCs für die regenerative Medizin in unbegrenzter Menge 1 erzeugt werden. Zellen von Patienten, die eine spezifische Krankheit hergestellt und verwendet, um in vitro Krankheitsmodellen 2,3 einzurichten. Solche Krankheitsmodelle können dann für große Wirkstoff-Screening auf der Suche nach neuer Wirkstoffe 4 sowie die Prüfung vorhandener Arzneimittel auf Wirksamkeit und Toxizität 5 eingesetzt werden. In-vitro-Krankheitsmodelle können zur Identifikation von neuen Krankheitsmechanismen führen. Für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie ist es wichtig, mit spezifischen arbeiten, gut zu definierenin der Krankheit von Interesse betroffen d Zelltypen. So ist die Verfügbarkeit von festen und reproduzierbare in vitro Differenzierung Protokolle von entscheidender Bedeutung für alle Anwendungen der hESC / hiPSC Technologie. Protokolle sind wünschenswert, die minimale Variabilität, Zeitaufwand, Mühe, Schwierigkeiten und Kosten sowie maximale Reproduzierbarkeit unter hESC / hiPSC Linien und verschiedene Forscher zeigen.
Neuralleiste (NC)-Zellen entstehen während der Wirbel Neurulation zwischen der Epidermis und dem neuronalen Epithel. Sie vermehren sich und wandern weitgehend in den sich entwickelnden Embryo und führen zu einer beeindruckenden Vielfalt der Nachkommen Zelltypen, einschließlich Knochen / Knorpel, kraniofazialen Skeletts, sensorische Nerven, Schwann-Zellen, die Melanozyten, glatte Muskelzellen, enterischen Neuronen, autonome Nervenzellen, chromaffinen Zellen , Herzscheidewand-Zellen, Zähne und Nebennieren / Schilddrüsenzellen 6. Somit NC-Zellen sind eine attraktive Zelltyp für die Stammzellfeld und wichtig für dieModellierung einer Vielzahl von Erkrankungen, wie Morbus Hirschsprung 7, familiärer Dysautonomie 8 sowie Krebserkrankungen, wie Neuroblastomen 9. Darüber hinaus bieten sie die Möglichkeit, Aspekte der menschlichen Embryonalentwicklung in vitro zu studieren.
Die derzeit verfügbaren und weit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen von hES 10,11 aufgebracht erfordert bis zu 35 Tage der Differenzierung und es beinhaltet neurale Induktion auf Stromazellen Feeder-Zellen, wie Zellen, MS5 und somit schlecht unter definierten Bedingungen durchgeführt. Zwar kann es sein skaliert, um große Mengen von NC-Zellen zu erzeugen, beispielsweise zum Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-4 erforderlich ist, ist dieser arbeits-und kostenintensiv. Darüber hinaus geht es um Hand Passagieren neuronaler Rosetten, die schwer zu reproduzieren können und damit unterliegt der Gesamtvariabilität, insbesondere, wenn es um eine Vielzahl von menschlichen embryonalen Stammzellen oder hiPSC angewendet wirdLinien. Hier wird die schrittweise Ableitung NC-Zellen in einem 18-Tage-Protokoll, das frei von Feederzellen ist gezeigt. Dieses Verfahren ist kürzer und definiert als das aktuell verwendete Protokoll. Darüber hinaus ist es sehr robust bei der Erzeugung NC-Zellen unter verschiedenen hiPSC Linien. Wichtig ist, wird gezeigt, dass die NC-Zellen durch beide Protokolle ergab entstehen an der Grenze von neuralen Rosetten (im Folgenden als Rosette-NC oder R-NC). Die Verwendung eines der beiden Protokolle abgeleiteten Zellen morphologisch identisch aussehen, können sie die gleichen NC-Marker exprimieren und Cluster zusammen in der Microarray-Analyse. NC-Zellen mit dem neuen Protokoll (R-NC) abgeleitet sind funktional, ähnlich wie NC-Zellen mit dem alten Protokoll (MS5-R-NC), so dass sie wandern können und weiter zu differenzieren zu Neuronen abgeleitet. Daher können die Zellen gleichzeitig mit den MS5-R-NC-Zellen verwendet werden. Die R-NC-Zelle-Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / iPS nützlich für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie, die die NC-Linie sein. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die erfolgreiche Differenzierung von R-NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / hiPSCs die folgenden Überlegungen sollten gemacht werden. Es ist kritisch, unter sterilen Kulturbedingungen jederzeit arbeiten. Insbesondere ist es wichtig, hpSC Kulturen für Mykoplasmen regelmäßig zu prüfen, da diese Kontamination erfolgreich Differenzierung behindern, aber nicht ohne weiteres visuell in hpSC Kulturen. Die R-NC Differenzierung sollte bei 90-100% Zelldichte eingeleitet werden; niedriger Zelldichte …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Und dem Tri-institutionellen Stammzellen-Initiative (Starr-Stiftung); Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für fortgeschrittene Forschende des Schweizerischen Nationalfonds und durch Zuschüsse aus NYSTEM (C026447 C026446) unterstützt.
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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