خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية
Summary
Abstract
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديها امكانات كبيرة لدراسة التطور الجنيني الإنسان، لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في طبق وكمصدر للخلايا زرع للتطبيقات التجدد بعد المرض أو الحوادث. قمة (NC) الخلايا العصبية هي السلائف لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا الجسدية للبالغين، مثل خلايا من النظام العصبي المحيطي والدبقية، الخلايا الصباغية وخلايا اللحمة المتوسطة. أنها تشكل مصدرا قيما للخلايا لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية، بما في ذلك تحديد مصير الخلية والهجرة. مزيد من تمايز الخلايا الاصلية NC في أنواع الخلايا المتمايزة عضال توفر إمكانية نمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في المختبر، والتحقيق في آليات المرض وتوليد خلايا للطب التجديدي. تقدم هذه المقالة التكيف من المتاحة حاليا في المختبر التمايز بروتوكول لاشتقاق خلايا NC من hPSCs. هذا البروتوكول الجديد يتطلب 18 يوما من differentiation، هو، بسهولة وقابلة للتكرار للغاية بين الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) خطوط وكذلك بفعل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط خالية من التغذية. البروتوكولات القديمة والجديدة على حد سواء تسفر عن الخلايا NC الهوية متساوية.
Introduction
وقد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSC) إمكانات هائلة، وخاصة للتحقيق والعلاج في المستقبل للأمراض البشرية التي لا نماذج حيوانية جيدة ولا الأنسجة الأولية المتاحة. أمثلة التطبيق للتكنولوجيا HESC / hiPSC ما يلي: يمكن أن تتولد خلايا ذات أهمية خاصة من HESC / hiPSCs الطب التجديدي في كمية غير محدودة 1. يمكن أن تنتج الخلايا من المرضى الذين يحملون مرض معين ويستخدم لإنشاء نماذج في المختبر المرض 2،3. ويمكن بعد هذه النماذج المرض استخدامها لفحص المخدرات على نطاق واسع في البحث عن مركبات الدواء الجديد 4 وكذلك اختبار الأدوية الموجودة لفعالية وسمية 5. في المختبر نماذج المرض يمكن أن تؤدي إلى التعرف على آليات المرض الرواية. لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية من المهم للعمل مع محددة وتحديد جيداد أنواع الخلايا المتضررة في هذا المرض من الاهتمام. وبالتالي، فإن توافر في المختبر البروتوكولات تمايز صلبة وقابلة للتكرار أمر بالغ الأهمية لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / hiPSC. البروتوكولات هي من المرغوب فيه أن تظهر الحد الأدنى من التقلبات، حساب الوقت والجهد، وصعوبة وتكلفة، وكذلك استنساخ القصوى بين خطوط HESC / hiPSC والباحثين مختلفة.
قمة العصبية (NC) الخلايا تظهر خلال الفقاريات تكون العصيبة بين البشرة والظهارة العصبية. أنها تتكاثر وتهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين النامية وتؤدي إلى تنوع هائل من أنواع الخلايا ذرية، بما في ذلك العظام / الغضروف، والهيكل العظمي القحفي والأعصاب الحسية، وخلايا شوان، الخلايا الصباغية، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا العصبية المعوية، الخلايا العصبية اللاإرادية، والخلايا أليفة الكروم وخلايا القلب الحاجز والأسنان والكظرية / الغدة الدرقية الخلايا الغدية 6. وبالتالي، NC الخلايا هي نوع من الخلايا جذابة للحقل الخلايا الجذعية وهامة لنماذج من مجموعة متنوعة من الأمراض، مثل أمراض هيرشسبرونغ 7، 8 العائلي خلل الوظائف المستقلة، وكذلك السرطانات مثل العصبية 9. وعلاوة على ذلك، فإنها توفر إمكانية لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية في المختبر.
المتاحة حاليا وتطبيقها على نطاق واسع في المختبر بروتوكول التمايز لاشتقاق خلايا NC من hESCs 10،11 يتطلب ما يصل الى 35 يوما من التمايز وأنها تنطوي على تحريض العصبية في خلايا انسجة المغذية مثل الخلايا MS5 وبالتالي تتم تحت ظروف محددة بشكل واضح. في حين أنه يمكن أن يصل تحجيم لتوليد كميات كبيرة من خلايا NC، على سبيل المثال المطلوبة للالإنتاجية العالية فحص المخدرات 4، وهذا هو العمل المكثف والتكلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على الركض دليل ريدات العصبية، والتي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها وبالتالي يخضع للتقلب بشكل عام، ولا سيما عندما يتم تطبيقه على مجموعة كبيرة ومتنوعة من HESC أو hiPSCخطوط. هنا، يظهر الاشتقاق تدريجي الخلايا NC في بروتوكول 18 يوما التي هي خالية من الخلايا المغذية. هذا الأسلوب هو أقصر وأكثر تحديدا من البروتوكول المستخدم حاليا. وعلاوة على ذلك، فمن قوي جدا في توليد خلايا NC بين خطوط hiPSC مختلفة. الأهم من ذلك، فإنه يظهر أن الخلايا NC التي حققها كلا البروتوكولين الظهور على الحدود بين ريدات العصبية (وهو ما يسمى الآخرة ريدة-NC أو R-NC). الخلايا المشتقة باستخدام أي من البروتوكولين تبدو متطابقة شكليا، فإنها تعبر عن نفسها علامات NC والكتلة معا في تحليل ميكروأري. خلايا NC المستمدة باستخدام البروتوكول الجديد (R-NC) وظيفية، مماثلة لخلايا NC المستمدة باستخدام بروتوكول القديمة (MS5-R-NC) بحيث يمكن ترحيل ومزيد من التمايز إلى خلايا عصبية. وبالتالي، فإن الخلايا يمكن استخدامها في نفس الوقت مع الخلايا MS5-R-NC. سوف بروتوكول الخلية R-NC لاشتقاق خلايا NC من HESC / التوجيهية أن تكون مفيدة لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية التي تنطوي على نسب NC </ ع>
Protocol
Representative Results
Discussion
لتمايز الخلايا ناجحة R-NC من HESC / hiPSCs ينبغي بذل الاعتبارات التالية. فمن الأهمية بمكان أن تعمل في ظل ظروف معقمة الثقافة في جميع الأوقات. على وجه الخصوص، من المهم لاختبار ثقافات hPSC للتلوث الميكوبلازما بشكل منتظم، لأن هذا التلوث سوف تعيق تمايز ناجحة، ولكن لا يمكن بسهولة يت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين متقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومن خلال المنح المقدمة من NYSTEM (C026446؛ C026447) ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
