Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller
Summary
Abstract
Menneske pluripotente stamceller (hPSCs) har stort potensial for å studere menneskelig embryoutvikling, for å modellere menneskelige sykdommer i fatet og som en kilde til transplant celler av regenerativ applikasjoner etter sykdom eller ulykker. Neural crest (NC)-celler, er forløperne for et stort utvalg av voksne somatiske celler, slik som celler fra det perifere nervesystemet og gliaceller, melanocytter og mesenkymale celler. De er en verdifull kilde til celler for å studere aspekter av menneskelig embryoutvikling, inkludert celle skjebne spesifikasjon og migrasjon. Ytterligere differensiering av NC stamceller til terminalt differensiert celletyper gir muligheten til å modellere menneskelige sykdommer in vitro, undersøke sykdomsmekanismer og generere celler for regenerativ medisin. Denne artikkelen presenterer den tilpasning av en for tiden tilgjengelig i vitro differensiering protokoll for avledning av NC celler fra hPSCs. Denne nye protokollen krever 18 dager med forskjellerrentiation, er mater fritt, lett skalerbar og svært reproduserbare blant humane embryonale stamceller (hESC) linjer samt menneskeskapte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer. Både gamle og nye protokoller gi NC celler med lik identitet.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSC) har vist enormt potensial, særlig for etterforskningen og fremtidig behandling av menneskelige sykdommer som verken gode dyremodeller eller primære vev er tilgjengelige. Eksempler på bruksområder for hESC / hiPSC teknologi er følgende: Celler av spesiell interesse kan genereres fra hESC / hiPSCs for regenerativ medisin ved ubegrenset kvantitet en. Celler kan bli produsert fra pasienter bærende en spesifikk sykdom, og brukt til å etablere in vitro-sykdomsmodeller 2,3. Slike sykdomsmodeller kan da bli ansatt for storskala narkotika screening i jakten på nye stoffet forbindelser 4 samt testing av eksisterende legemidler for effekt og giftighet fem. In vitro sykdom modeller kan føre til identifisering av nye sykdomsmekanismer. For alle anvendelser av hESC / iPSC teknologi er det viktig å jobbe med spesifikke, godt definered celletyper som påvirkes i sykdommen av interesse. Således er tilgjengeligheten av faste og reproduserbare in vitro differensiering protokoller avgjørende for alle anvendelser av hESC / hiPSC teknologi. Protokoller er ønskelig som viser minimal variasjon, tidskostnad, krefter, problemer og kostnader samt maksimal reproduserbarhet blant hESC / hiPSC linjer og ulike forskere.
Neural crest (NC) celler dukke opp i løpet av virveldyr neurulation mellom epidermis og nevrale epitel. De sprer og migrere mye rundt utvikling av embryo og gi opphav til et imponerende mangfold av avkom celletyper, inkludert bein / brusk, den kraniofaciale skjelett, sensoriske nerver, Schwann celler, melanocytter, glatte muskelceller, enteriske nerveceller, autonome nevroner, kromaffinceller , hjerte septum celler, tenner og binyrer / skjoldbruskkjertelceller seks. Således, NC-celler er en attraktiv celletype for stamcellefeltet og viktig formodellering av en rekke sykdommer, for eksempel Hirschsprungs sykdom 7, Familial Dysautonomia 8 samt kreftformer som neuroblastom 9.. Videre tilbyr de muligheten til å studere aspekter ved humane embryonale utvikling in vitro.
Den tiden tilgjengelig og mye brukt in vitro differensiering protokoll for avledning av NC celler fra hESCs 10,11 krever opp til 35 dager av differensiering og det innebærer neural induksjon på stromal mater celler som MS5 celler og er dermed utført under uklare forhold. Selv om det kan være opp-skalert for å generere store mengder av NC-celler, for eksempel som kreves for high-throughput screening medikament 4, er denne arbeids-og kostnadskrevende. Videre innebærer det manuell aging av nevrale rosetter, som kan være vanskelig å reprodusere og dermed er underlagt generelle variasjonen, særlig når den brukes til et stort utvalg av hESC eller hiPSClinjer. Her blir trinnvis avledning av NC-celler i en 18-dagers protokoll som er fri for mateceller vist. Denne metoden er kortere og mer definert enn i dag brukes protokollen. Videre er det svært robust i å generere NC celler mellom ulike hiPSC linjer. Viktigere er det vist at NC cellene overgitt av begge protokollene dukke opp på grensen av nevrale rosetter (heretter kalt rosett-NC eller R-NC). Cellene avledet ved hjelp av en av de to protokollene ser morfologisk identiske, de uttrykker de samme NC markører og klynge sammen i mikromatriseanalyse. NC-celler avledet ved hjelp av den nye protokoll (R-NC) er funksjonelle, i likhet med NC-celler avledet ved hjelp av den gamle protokoll (MS5-R-NC), slik at de kan migrere og videre differensiere til neuroner. Derfor kan cellene bli brukt samtidig med MS5-R-NC-celler. Den R-NC celle protokollen for avledning av NC celler fra hESC / iPSC vil være nyttig for alle anvendelser av hESC / iPSC teknologi som involverer NC avstamning. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
For den vellykkede differensiering av R-NC celler fra hESC / hiPSCs følgende hensyn bør gjøres. Det er viktig å arbeide under sterile kultur forhold til alle tider. Spesielt er det viktig å teste hPSC kulturer for mycoplasma forurensning regelmessig, siden dette vil hindre forurensning vellykket differensiering, men kan ikke lett kan oppdages visuelt i hPSC kulturer. Den R-NC differensiering bør startes med 90-100% celle tetthet; lavere celletetthet påvirker cellers overlevelse og effektiviteten av R-NC differens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap for avanserte forskere fra den sveitsiske National Science Foundation og gjennom tilskudd fra NYSTEM (C026446; C026447) og Tri-institusjonelle stamcelle initiativ (Starr Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
