Vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nei processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro o come potenziali agenti terapeutici nella consegna di droga o medicina rigenerativa. Questo protocollo presenta metodi per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione di isolati e non isolati vescicole extracellulari in diversi fluidi con settaggio di rilevamento di impulsi resistivo.
Vescicole extracellulari (SVE), tra cui 'microvescicole' e 'exosomes', sono molto abbondanti nei fluidi corporei. Negli ultimi anni si è assistito ad un enorme aumento di interesse per i veicoli elettrici. Veicoli elettrici hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante in vari processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro. Inoltre, i veicoli elettrici hanno un potenziale come agenti terapeutici, ad esempio come veicoli di consegna della droga o come la medicina rigenerativa. A causa delle loro piccole dimensioni (da 50 a 1000 nm) quantificazione accurata e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici è tecnicamente impegnativo.
Questo protocollo descrive come sintonizzabile tecnologia di rilevamento di impulsi resistivo (TRP), utilizzando il sistema qNano, può essere utilizzato per determinare la concentrazione e le dimensioni dei veicoli elettrici. Il metodo, che si basa sulla rilevazione dei veicoli elettrici su loro trasferimento attraverso un poro di dimensioni nano, è relativamente veloce, è sufficiente l'uso di piccoli volumi di campione e non richiede la purificazione e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo regolare funzionamento di un approccio alternativo è descritta utilizzando campioni diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione. Questo tempo reale tecnica di calibrazione può essere utilizzato per superare ostacoli tecnici rilevato quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici.
Le vescicole di origine cellulare sono molto abbondanti nei fluidi corporei 1. Queste cosiddette vescicole extracellulari (SVE) (50 – 1.000 nm dimensioni) sono formate da una fusione di corpi multi vescicolari con la membrana cellulare o per gemmazione diretta verso l'esterno della membrana cellulare. Negli ultimi anni, l'interesse scientifico nei veicoli elettrici è notevolmente aumentato, con conseguente in una pletora di pubblicazioni EV-focalizzato, in cui nuove funzioni e le caratteristiche dei veicoli elettrici sono descritte 1. EVs sono ora crede di essere coinvolti in una vasta gamma di processi fisiologici e patologici, quali la trasduzione del segnale, regolazione immunitaria, e la coagulazione del sangue 1-4. Nel cancro, veicoli elettrici sembrano giocare un ruolo nella formazione di nicchie premetastatic 5,6, il trasferimento di contenuti pro-cancerose 7,8 e la stimolazione dell'angiogenesi 8. Oltre a questo, i veicoli elettrici sono esplorate come agenti di consegna di agenti terapeutici 9.
Nonostante questi desvi-, quantificazione affidabile di veicoli elettrici rimane impegnativo. Tradizionalmente, vengono utilizzati metodi di quantificazione indiretti, che si basano sulla quantificazione del contenuto proteico totale o proteine specifiche. Anche se usato in generale, queste tecniche non tengono conto delle differenze di proteine-per-EV, e non discriminano tra contaminare aggregati proteici e proteine in veicoli elettrici. Inoltre, queste tecniche richiedono isolamento di PA, che in molti casi rende confronto delle concentrazioni EV in campioni biologici impossibile.
Pertanto, gli sforzi sono intraprese per sviluppare nuovi metodi che permettono di misurazione più preciso e diretto EV 10. Questo rapporto descrive l'uso di rilevamento dell'impulso resistivo regolabile (TRP) per la quantificazione affidabile e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici.
Attualmente, il qNano strumento (Figura 1a) è l'unica piattaforma disponibile in commercio per TrPs. In TrPs, una membrana elastica non conduttiva punteggiato with un poro di dimensioni nanometriche è che separa due cellule del liquido. Una delle cellule del liquido è riempito con il campione di interesse, mentre l'altra cella è riempita con elettrolita libero-particella. Applicando una tensione, si stabilisce un flusso / corrente elettrica ionica, che viene modificato in caso di trasferimento delle particelle attraverso il poro (Figura 1b). L'entità di questo blocco corrente ('impulso resistivo') è proporzionale al volume della particella 11 (figura 1c). La durata del blocco può essere utilizzato per valutare la zeta-potenziale di particelle, che si basa sulle caratteristiche delle particelle come la carica o la forma 12. Dimensioni profilatura di particelle sconosciute può essere eseguita confrontando gli impulsi resistivi causate dalle particelle sconosciute con gli impulsi resistivi causati da particelle di calibrazione con diametro noto. Oltre alla grandezza di un evento di blocco, il tasso di cui questi si verificano viene misurato. Questo tasso di conteggio relies sulla concentrazione di particelle. Poiché la concentrazione ed il tasso di blocchi sono linearmente proporzionale 13, utilizzando un unico campione di calibrazione con particelle di concentrazione nota e granulometria consente la misurazione della concentrazione di 14 e 11 distribuzione dimensionale di un campione sconosciuto.
Il movimento delle particelle attraverso il nanoporo è determinata da forze elettro kinetic- (elettroforesi e elettro-osmotica) e fluidici 15. Utilizzando il modulo di pressione variabile (VPM) una differenza di pressione tra le cellule del liquido può essere indotta da una forza aggiuntiva. L'applicazione di una pressione positiva aumenta il flusso di particelle, che possono essere di beneficio quando la concentrazione di particelle è bassa. Inoltre, la pressione può essere applicata per ridurre l'effetto delle forze elettro-cinetico. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza nanopori con piccolo diametro dei pori relativa (NP100, NP150 e NP200 possibilmente) come spesso utilizzato per la rilevazione dei veicoli elettrici.Per questi nanopori, anche quando applicando una pressione significativa, le forze elettro-cinetica possono, a seconda della carica superficiale delle particelle, rimangono non trascurabile 16. Misurando la velocità delle particelle a molteplici pressioni, un elettro cineticamente corretto, e quindi più accurata, concentrazione EV può essere calcolato.
Qui, sono previsti protocolli dettagliati per determinare la distribuzione dimensionale e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo di regolare funzionamento, un approccio alternativo è descritto in cui i campioni vengono diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione 17. Questa tecnica di calibrazione in tempo reale può essere utilizzata per superare alcune delle difficoltà tecniche incontrate quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici, quali urina, plasma e coltura cellulare surnatante, o quando la stabilità del nanoporo per un lungo periodo di tempo di misura non può essere assicurata.
I protocolli descritti in questo manoscritto offrono metodologie per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione dei veicoli elettrici che utilizzano TrPs. I principali vantaggi della piattaforma TrPs sono la piccola dimensione del campione, la misurazione di breve durata relativa e l'assenza di manipolazione del campione richiesto.
Prerequisito per la misurazione accurata TrPs è quello di mantenere condizioni identiche tra le misurazioni di calibrazione e il campione. Questo comprende l'utilizzo di buffer identici così come le impostazioni dello strumento identiche, come la dimensione nanoporo, la tensione e la pressione applicata. L'originale VPM manca di un meccanismo per la regolazione precisa della pressione applicata, provocando piccole differenze di pressione applicata tra i campioni. Inoltre, l'evaporazione del liquido adescamento della VPM può indurre lievi differenze di pressione durante la misurazione in diversi momenti e la VPM deve quindi spesso essere re-innescato. Queste limitazioni sono state potenzialmente risolti dalla introduzione del VPM2, cheha una scala basato sui click e si basa pressione dell'aria.
Il protocollo alternativo descritto in questo manoscritto è particolarmente adatto per la misura di EVs in campioni biologici purificati non 17. Noi crediamo che i componenti tampone, come zuccheri, lipidi, proteine e altri detriti più grandi, può in alcuni casi influenzano le condizioni di misura troppo per il protocollo standard applicabile. L'aggiunta di perline di calibrazione per il campione, piuttosto che il confronto di due misure distinte introduce 'di calibrazione in tempo reale'. Questo metodo è particolarmente indicato quando si confrontano i campioni (ad esempio plasma sanguigno di diversi donatori) che hanno diverse e / o sconosciuti contenuti di sfondo fluidici. Sebbene esistano differenze tra i veicoli elettrici e le particelle di polistirene (ad esempio, densità delle particelle e la carica di superficie), modelli teorici e dati sperimentali sottolineare l'usabilità di perle di polistirene per la quantificazione e la dimensione profilatura dei veicoli elettrici,sotto il presupposto che la pressione significativa viene applicata 15,19. Per ridurre al minimo l'influenza di forze elettrocinetiche, si consiglia l'utilizzo del relativamente più grande NP150 / NP200 nanopore e significativa pressione positiva.
EV e perline di calibrazione si distinguono per dimensioni. Di conseguenza, il nanoporo deve essere aperto applicando tratto, ad un diametro dove si osserva individuazione dei veicoli elettrici e le particelle più grandi di calibrazione. Dal momento che l'apertura del poro diminuisce la sensibilità verso particelle più piccole, solo SVE più grandi di una certa dimensione sono registrati (spesso EVs> 120 nm utilizzando un cordone di calibrazione 335 nm). Il limite minimo di rilevazione per i veicoli elettrici può essere ridotto a circa 90 nm, utilizzando 203 nm perline di calibrazione su un nanoporo NP150. Tuttavia, questa configurazione potrebbe essere impraticabile quando i veicoli elettrici più grandi inducono frequente intasamento del nanoporo. La presenza di questi veicoli elettrici che ostacolano può forzare l'utilizzo di una configurazione in cui una popolazione di PA, troppo piccolo per reach la soglia di rilevamento, non verrà rilevata.
La difficoltà di operare del sistema aumenta quando si cerca di misurare le particelle di dimensioni inferiori a 100 nm di dimensione. In tali casi, il rilevamento può essere migliorata aumentando la concentrazione di sale dell'elettrolito. Un aumento della concentrazione di ioni indurrà relativamente aumento delle grandezze del blocco per le piccole particelle (maggiore rapporto segnale-rumore). La vitalità di questa tecnica per le misurazioni di veicoli elettrici deve essere convalidato, però, come l'aumento delle concentrazioni di sale possono influenzare il volume dei veicoli elettrici.
In conclusione, la piattaforma TrPs può essere utilizzata per la quantificazione diretta e dimensioni caratterizzazione dei veicoli elettrici. Dal momento che non è necessario alcun isolamento o manipolazione EV (anticorpo etichettatura vincolante o fluorescente), la piattaforma è adatta per la quantificazione EV diretta nei fluidi biologici. Un protocollo alternativo è previsto che può essere utile per i campioni in cui i componenti tampone inducono significativo di intasamento dei porig eventi, rendendo l'utilizzo affidabile del protocollo standard impraticabile.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |