細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。
「微小胞」と「エキソソーム」を含む細胞外小胞(電気自動車)は、体液中の非常に豊富である。近年、電気自動車への関心が驚異的な増加を目撃した。電気自動車は、凝固、免疫応答、および癌を含む、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。また、電気自動車は、治療薬として、例えば、薬物送達ビヒクルとして、又は再生医療などの可能性を有する。サイズが小さいため(50〜1,000 nm)でのEVの正確な定量とサイズプロファイリングが技術的に困難である。
このプロトコルがどのように調整可能な抵抗パルス検出(のTRP)技術について説明し、qNanoシステムを使用して、電気自動車の濃度とサイズを決定するために用いることができる。ナノサイズの細孔を通じて転送するとEVの検出に依存する方法では、比較的高速であり、少量の試料を使用することで十分とPURを必要としませんificationやEVの濃度。次の別のアプローチは、サンプルを使用して記述されている通常動作プロトコルに既知のサイズおよび濃度のポリスチレンビーズでスパイクした。このリアルタイムの較正技術は、生物学的液体中の直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的ハードルを克服するために使用することができる。
細胞起源からの小胞は、体液1において非常に豊富である。これらのいわゆる細胞外小胞(電気自動車)(50 – サイズ1,000 nm)を細胞膜と多小胞状体のいずれかの融合によって、または細胞膜の外側に直接出芽により形成されている。近年では、電気自動車での科学的関心が大幅にEVの新たな機能や特性を1に記載されているEVに焦点を当てた出版物の過多で、その結果、増加している。電気自動車は、現在、シグナル伝達、免疫調節、および血液凝固1-4のような生理学的および病理学的プロセスの広い配列に関与すると考えられている。癌では、電気自動車はpremetastaticニッチ5,6、血管新生8のプロ癌コンテンツ7,8の移転や刺激の形成に役割を果たしているようだ。このほか、電気自動車は、治療剤9の送達剤として検討されている。
これらのデにもかかわらずvelopments、EVの信頼性の高い定量が困難なままである。伝統的に、間接的な定量法は、全タンパク質含有量または特定のタンパク質の定量化に依存している、使用されている。広く用いられているが、これらの技術は、タンパク質あたりのEVの違いを考慮していないし、電気自動車におけるタンパク質凝集体および混入タンパク質を区別しません。さらに、これらの技術は、多くの場合、生物学的サンプル中のEV濃度の比較を不可能にする電気自動車の単離を必要とする。
したがって、努力がより正確で直接的なEV測定10を可能にする新規な方法を開発するために行われている。このレポートは、信頼性の高い定量化やEVのサイズのプロファイリングのための調整可能な抵抗パルス検出(TRPS)の使用が記載されている。
現在、qNano装置( 図1a)は、TRPSのための唯一の商業的に入手可能なプラットフォームです。 TRPSでは、非導電性弾性膜は、Wiを中断ナノサイズの細孔番目の二つの流体細胞を分離している。他の細胞は、粒子を含まない電解質で満たされ、一方、流体セルの一つは、目的の試料が充填されている。電圧を印加して、イオン流/電流が細孔( 図1b)を介して粒子の移動時に変更される、確立される。この電流の遮断(「抵抗パルス')の大きさは、粒子11( 図1c)の体積に比例する。封鎖持続時間は、電荷または12形状の粒子の特性に依存して、粒子のゼータ電位を評価するために用いることができる。未知の粒子の大きさプロファイリングは、既知の直径を有する較正粒子による抵抗パルスで未知の粒子による抵抗パルスを比較することによって行うことができる。封鎖事象の大きさに加えて、これらが生じるの速度が測定される。この計数率reli粒子濃度でのES。封鎖の濃度および割合は、13直線的に比例しているので、既知の濃度および粒子サイズの粒子を有する単一の較正サンプルを用いて、濃度14および未知試料のサイズ分布11の測定を可能にする。
ナノポアを通る粒子の移動は、電気キネティック(電気泳動および電気浸透)と流体力15によって決定される。可変圧力モジュール(VPM)流体セル間の圧力差を使用して、追加の力として誘導することができる。正の圧力を適用すると、粒子濃度が低い場合に有益であり得る粒子の流量を増加させる。また、圧力は、動電学的な力の影響を低減するために適用することができる。としてしばしば電気自動車を検出するために使用される相対小さな孔径(NP100、NP150およびNP200おそらく)でナノ細孔を使用する場合に特に重要である。これらのナノ細孔のために、かなりの圧力を加える場合であっても、動電学的力は、粒子の表面電荷に依存して、16無視できないままであり得る。複数の圧力での粒子速度を測定することにより、電気を動力学的に補正し、より正確な、EV濃度を算出することができる。
ここでは、詳細なプロトコルはEVのサイズ分布および濃度を決定するために提供される。サンプルは既知のサイズ及び濃度17のポリスチレンビーズでスパイクされた場合、通常動作プロトコルの隣には、別のアプローチが記載されている。このリアルタイムの較正技術は、尿、血漿および細胞培養上清のような生物学的流体、直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的課題のいくつかを克服するために使用することができ、または測定長期間にわたってナノポアの安定性であることができない場合確実にした。
定量化とのTRPを使用して、電気自動車の大きさの特徴付けのためにこの原稿募集の方法論に記載されているプロトコルを。のTRPプラットフォームの主な利点は、小さなサンプルサイズ、比較的短い測定時間と必要なサンプル操作の欠如である。
正確なのTRP測定のための前提条件は、校正とサンプルの測定値の間で同一の条件を維持することです。これは、同一のバッファの使用方法ならびにそのようなナノ細孔の大きさ、電圧、印加された圧力と同一の機器の設定を包含する。オリジナルのVPMは、それによって、サンプル間の印加圧力のわずかな違いを引き起こし、加えられた圧力の正確な設定のためのメカニズムを欠いている。異なる時点で測定したときにも、VPMにおけるプライミング液の蒸発はわずかな圧力差を誘発することができ、VPMは、したがって、多くの場合、再プライミングされるべきである。これらの制限は、潜在的にVPM2の導入によって解決されているクリックベースのスケーリングを有し、空気圧基づいている。
この原稿に記載されて代替プロトコルは、非精製された生物学的サンプル中17 EVの測定に特に適している。私たちは、例えば、糖、脂質、タンパク質および他の大きな破片などの緩衝成分は、いくつかの場合に適用可能にする標準プロトコルのためのあまり測定条件に影響を与えることができると考えている。 2個別の測定値を比較するサンプルにキャリブレーションビーズを添加するというよりは、「リアルタイム·キャリブレーション」を紹介します。異なるおよび/ または未知の流体背景含量を有するサンプル(異なるドナーの、例えば血漿)を比較する場合は、この方法が特に適している。違いはEVやポリスチレン粒子( 例えば、粒子密度及び表面電荷)との間に存在するが、理論モデルならびに実験データは、EVの定量化およびサイズプロファイリングのためのポリスチレンビーズの有用性を強調するかなりの圧力が15,19適用されていることを前提条件の下で。動電力の影響を最小限に抑えるために、比較的大きなNP150 / NP200のナノ細孔と有意な正の圧力の使用が推奨されます。
EVやキャリブレーションビーズは大きさによって区別される。したがって、ナノポアは、EVや大きな校正粒子の両方の検出が観察される直径に、ストレッチを適用することによって開かれなければならない。気孔の開口部が、より小さい粒子に対する感受性が減少するので(335 nmのキャリブレーションビーズを使用する場合>しばしば電気自動車120 nm)を、特定のサイズよりも大きいのみ電気自動車が記録される。電気自動車の最小検出限界は、NP150のナノ細孔に203 nmのキャリブレーションビーズを用いて、90nm程度まで小さくすることができる。より大きな電気自動車のナノ細孔を頻繁に目詰まりを誘発しかし、このセットアップは実行不可能かもしれません。これらの妨害EVの存在はどこにレアには小さすぎるEVの人口、セットアップの利用を強制することが検出閾値をCHであり、検出されません。
サイズが100nm未満の粒子を測定しようとすると、システムを操作する困難さは増大する。このような場合において、検出は、電解質の塩濃度を増加させることによって改善することができる。増大したイオン濃度は、小さな粒子(より大きな信号対雑音比)が相対的に増加封鎖大きさを誘導する。 EVの測定のためのこの技術の実行可能性が増加塩濃度は、EVの容積に影響を与える可能性がある、しかし、検証されなければならない。
結論として、TRPをプラットフォームは、EVの直接定量およびサイズ特徴付けのために使用することができる。全く隔離またはEV操作(抗体結合または蛍光標識)が必要ないので、プラットフォームは生物学的液体中の直接のEV定量化に適しています。代替プロトコルは、緩衝液成分が有意な細孔clogginを誘導サンプルのために有益であり得るが提供される実行不可能な標準プロトコルの信頼性の高い使用率を作るグラムイベント。
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |