Protocol
注：在本协议中描述的所有动物的相关手续已在杜克大学机构动物护理和使用委员会（DUIACUC）事先批准。
1.癌症细胞培养和注射
- 培养荧光标记的转移性肿瘤细胞（ 如人力MDAMB231-GFP乳腺癌细胞，从帕特里夏Steeg的博士，NCI和YFP标记的小鼠肉瘤细胞，从大卫·基尔希博士，美国杜克大学医学中心放射肿瘤学系的礼品赠送）在适当的培养基（ 例如 Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）中，用10％胎牛血清和1％青霉素/链霉），在37℃，直到大约90％汇合。
- Trypsinize细胞，用PBS冲洗2次，计数，然后将它们注入尾静脉异氟烷麻醉10周龄女性裸体老鼠每动物5000000细胞，使用带有27G的针头的注射器。手术水平anesthesIA是由缺乏反应脚趾捏的验证。
2.监控转移使用显微的
- 用微型CT /微辐射器，以检测转移灶的直径大于约2mm的直径的存在下，每周检查一次大鼠。在显微CT委托如前所述12。
- 受试者大鼠成像之前的3％异氟烷麻醉。确认通过脚趾捏深麻醉。
- 发病麻醉后，迅速大鼠在成像腔室转移至成像支架和经由鼻锥在2.5-3％连接到一个异氟醚 - 空气混合物。调整在其胸部被定位在显微扫描仪的光子束的方法的摇篮的大鼠的位置，使用在成像支架的外部位置的控制和激光定界符。确保门成像室是封闭的，以从伽马射线遮蔽研究者。
- 控制动物的再次使用位置彩色摄像机。执行低分辨率CT成像试运行，并使用所产生的图像，以视场调整到胸腔的XYZ尺寸。
- 图像使用2毫米的Al滤波器大鼠胸廓在40 kVp的，2.5毫安，并0.008体素在7 FPS和返回动物笼子。一只动物的成像应不超过15或20分钟。不返回已经历手术给其他动物的公司，直到完全恢复的动物。不要让动物无人看管，直到它恢复足够的意识，保持胸骨斜卧。
- 通过相对不透射线的物体的外观不能由胸内的血管进行说明确认转移（ 图1A）
3.窗口商会外科
- 麻醉，生命体征和尾静脉插管
- 转移性疾病的存在选择的动物。注入动物腹膜内ðOSE的50毫克/公斤戊巴比妥。出发前确认所捏脚趾手术级别的麻醉。
注：麻醉的协议应该匹配到相应的实验装置。戊巴比妥这里被选为长效麻醉剂，以诱导麻醉深为冗长的程序，同时提供容易的重新给药的选项。但是，动物的损失用药过量是一种常见的问题戊巴比妥麻醉。它保留自主反射到更大的程度比巴比妥另一种选择是氯胺酮结合镇静剂如赛拉嗪或美托咪定，仅在单次再给药周期然而其允许。 - 剃上具有转移性疾病，并且在颈部区域中的主体的侧面的动物，使用一个削波器。擦去从皮肤所有剩余松散的头发。后松散的头发被删除，适用兽医药膏眼睛，以防止它们干燥。
注：无胸腺裸鼠体内可能有残留的头发requi在进行外科手术前，水库搬迁。这是非常重要的，以彻底去除所有的头发的，因为它可以与外科手术和成像干涉。 - 修复的动物在被放置在37℃的水中循环加热垫的金属板仰卧位置。前面和后肢肢体被固定在板上用胶带。
注：它是非常有用的控制，并通过使用一个脉冲血氧计，在整个手术和实验程序记录生命体征，如心脏速率和动脉血液充氧。
- 转移性疾病的存在选择的动物。注入动物腹膜内ðOSE的50毫克/公斤戊巴比妥。出发前确认所捏脚趾手术级别的麻醉。
- 气管插管
- 在以设置一个导管的动物的通风，首先使横向颈部皮肤切口，接着沿纵向肌肉腹侧气管的中位数的分离。
- 使用重复打开到关闭动作用尖锐的镊子通过气管的背侧以创建一个通道的缝合。
- 做一个小切口，插入吨气管他腹侧，不超过半圆形，大致在第二和第三气管环之间。留足够长的暴露在背表面气管部，以使所述气管导管的固定。
- 将2.5〜3.0mm的“Y”气管插管进入气管，并拧紧了4-0单丝缝合。确保套管连接到一个压力循环通风机与连接到期满导管填充有6厘米水的瓶子，以维持正肺动脉压。流入的气体应是100％的氧气，除非实验所需的除外。
- 插入一个导管具有25-27ģ针，并且填充有肝素生理盐水到尾静脉大鼠中的一个，并代替用胶带固定。
注：确保尾静脉导管的通畅整个过程通过重复注入少量肝素的生理盐水到尾静脉。此外，奥罗气管插管，即气管指导经由麻醉动物的嘴和过去的喉部进入气管管，是一种可能的替代方案是这里描述的气管切开术过程。然而，该方法需要特别的训练和经验，以避免损坏气管，并且也排除食道的意外插管。
- 肺窗应用
- 从胸部其中转移性疾病位于的一侧去除皮肤，通过创建一个切口，然后用钝器解剖分离皮肤。
注：皮肤被切除，并去除随后支队 - 通过解剖重叠肌肉（胸，锯，以及背阔肌）的两个层，但留下肋间肌完好进行。在约1.5厘米胸腔直径创建一个穿孔，通过除去通常两个相邻的肋的某些部分。理想情况下，找到穿孔在第六和第七r的地区肠易激综合征。
- 截骨术：
- 为了最大限度地减少出血和损害肺表面上，紧紧地保持肋在切割期间被切割带齿外科钳子。用手术剪，切内侧肋的第一，在大约45°的角度，余下的肋骨指向外面的尖端侧。
- 随后，切开肋骨的侧面以类似的方式，再次离开肋骨指向外部，以防止损坏的肺表面的尖端侧。
- 重复该过程的相邻肋骨，然后切开肋间肌肉，去除切一块。在此过程中，维持的方式，肺表面和肋笼之间的机械相互作用被最小化肺压力。通过适当地调节呼吸机呼吸压力做到这一点。
- 插入窗口的：
- 插入定制肺窗口，包括一个玻璃罩即是连接到一个有机玻璃插座（ 图1B）。通过胶粘，或者通过施加非常少量的真空润滑脂附着窗口套接字。插入窗口的方式，表面的转移都位于靠近窗口的中心。如果需要的话，调整所插入的孔通过稍微扩大孔向各个侧带来的微转移到窗口的中心。
注：在胸膜表面转移性疾病可以被识别为肺表面的粉红色，否则对鲑鱼的彩色健康部分出现主要沿裂隙内清楚地辨认白色点或区域。虽然微可以发生在胸腔外的其他领域，被调查的细胞系几乎总是显示浮现在微穿孔区域，一旦转移性疾病可放射学检测。 - 插入插座插入穿孔，以及创建与所述升的内脏胸膜直接接触后UNG，缝合窗框的边缘向周围肋间肌，使用4.0单丝缝合（ 图1C）。使用呼吸机呼吸压力略有增加，以帮助残留的空气逸出，并创建一个密封。
注意：大鼠的呼吸速率可有很大变化，这取决于麻醉，兴奋或焦虑的状态中，吸入空气中的氧浓度（氧合指数2）等的状态，是值得推荐的，调整70和90次之间的呼吸速率。吸气压力应调节谨慎和不被设置为大于大约8厘米的H 2 O（0.6毫米汞柱），以避免损坏肺表面。
- 插入定制肺窗口，包括一个玻璃罩即是连接到一个有机玻璃插座（ 图1B）。通过胶粘，或者通过施加非常少量的真空润滑脂附着窗口套接字。插入窗口的方式，表面的转移都位于靠近窗口的中心。如果需要的话，调整所插入的孔通过稍微扩大孔向各个侧带来的微转移到窗口的中心。
- 定位动物中，其被设计来消除Z方向运动（ 图1D）上被定位在恒温（电）加热毯的钢板定制设计的阻 挡器，在荧光显微镜下。控制动物的身体温度用直肠热敏电阻。调节动物限制器的螺丝，和呼吸机上的吸气压力来实现横向移动的最佳控制。
注：自然呼吸的哺乳动物包括三个方向运动肺和胸部延伸：双边，背腹和头尾。为了保存自然呼吸运动尽可能，它以最小化Z方向压缩到必要的程度是重要的。因为在Z维约束具有引入可能影响血液流动等参数工件的电位，最好是串联在同一动物重复测量过程中保持恒定的条件。
- 从胸部其中转移性疾病位于的一侧去除皮肤，通过创建一个切口，然后用钝器解剖分离皮肤。
4.成像测量血液微循环和
- 通过心脏穿刺收集的红细胞和如先前所描述的DiI（1,1 = -dioctadecyl -3,3,3 =，3 =四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）标记它们，<SUP> 10。
- 注入300微升标记的红血细胞到尾静脉的大鼠的窗口腔手术完成之前，为了避免首过效应的粘附到玻璃窗口。消除任何气泡在注射器或导管，如引入空气进入静脉将抑制任何进一步的注射。
- 图像血流用显微镜CCD照相机在-40℃冷却的芯片温度，和大约100X总分辨率（ 即用10X显微镜物镜，和10X预相机目镜）。使用标准的罗丹明/ TRITC滤光片组（激发波长450-490，发射> 515纳米）。记录所得到的图像序列的实际帧速率和像素分辨率。每个堆栈记录至少200（最好约300）的图像，以确保流速的成功分析。
- 通过注入每一个小时约1毫升生理盐水知识产权的补充在动物体液丢失。
注：涉及干预实验设置， 如一种药物，用于修改在肺癌转移的血流速度，需要血流速度的肺转移癌的重复测量。对于这些扩展实验，以补充足够的流体，动物是非常重要的。 - 安乐死的动物通过输注3毫升3N氯化钾到尾静脉
- 评估采用发表，公开可用的基于Matlab的计算机算法，将创建流速灰度和彩色编码图所有的血流痕迹10,11图像栈。随后评价所形成的灰度图像通过使用商业或公开可用的图像分析软件，如的Image J，阈值化的折扣值，表明血细胞的无运动， 即没有活性脉管之后。
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Representative Results
在实体瘤的脉管系统是已知的，从正常供血显著不同，表示更大程度的扭曲的，并且更高intervascular距离13。因此，当相比于正常肺微循环（ 图2A，上图）中的实验性肺乳腺癌和肉瘤转移血流磁道具有不规则的形状和大intervascular间隙（ 图2A，下两个面板）。在先前的研究中，肺窗口方法的能力证明，可以执行正常的肺10的变化中的血流速度的自动测量。为了研究肺窗口方法是否也能测量在肺转移的增加血流速度，所述拟交感神经药物麻黄碱和认为最近已经发现，增加微血管循环在健康的肺的内皮素受体阻滞剂ambrisentan的药物组合，在这里应用（审查数据在其他地方）。在这项研究中，该方法的能力是示出用于检测的增加在小鼠肉瘤，引起与麻黄碱的组合给药的肺转移瘤的血流速度（20毫克/千克）和内皮素受体拮抗剂ambrisentan（0.5毫克/公斤，这两种药物腹膜内， 图2B）。每一数据点代表三次测量五分钟的时间间隔的共用的个体的平均值，平均值在5动物中获取的数据。在第一次注射显著（P <0.01）增加的血流速度在肿瘤区域从0.61±0.12毫米/秒至0.74±0.19，而在第二次注射维持升高的流速在0.74±0.19毫米/秒（）。在第二次注射没有引起在血流速度的任何进一步增加。 N = 5，所有的统计数据：重复测量ANOVA。
图1：对大鼠轴承肺转移（箭头） 操作步骤以制备肺转移轴承鼠实时显微成像（A）的显微图像（B）肺窗框（C）的大鼠胸壁穿孔和肺窗口。附。（D）的约束装置，以限制Z方向胸部运动。在荧光显微镜下（E）的大鼠与窗腔和抑制装置。注：面板C和E秀发轴承SD大鼠，不无胸腺裸鼠体内。
图2：增加的肺转移瘤的血流的定量。 （A）的血流量的方向和速度在正常肺，并从MDAMB-231和小鼠肉瘤癌转移。在左侧的列包含从图像系列荧光显微照片的卡扣杆。 Alveolae可以被识别为在正常肺中的背景荧光图案（上图）的一部分。转移可位于由所引起的注射癌细胞（虚线）的内源性荧光蛋白的荧光。列权：血流方向的彩色编码图（彩色指示器轮痕的方向朝着哪些细胞流）和流速，以毫米计量/秒（B）反复注射液联合麻黄碱后改变微循环血流量和ambrisentan（20和0.1毫克/公斤每次注射）。在总体流速甲显著增加（重复测量ANOVA，P <0.01）观察到在第一次注射后，但不经过所述第二（N = 5）。
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Discussion
一个模型提出即是可行的，使用活体显微镜和计算血流分析在血液微循环和大鼠的肺转移其它动态过程，图像的变化。而其他方法存在于啮齿动物的开放ribcages暴露肺部进行显微镜，这种模式也是通过胸壁穿孔封闭胸设置的第一个图像肺转移。使用这种方法的可行性被示为测量药理学诱导的变化的微循环血液肺转移的流动。
两种基本方法存在图像的生活啮齿类是由自发血流灌注，直接接触到肺表面肺：开胸模型消除因呼吸和心脏活动肺的不断运动的问题，通过施加抽吸窗口到肺的表面上，同时允许心肺复杂的其余部分为exp而与开放式胸腔内7,14合同。虽然这种方法提供了极好的试验获得，在开胸条件和吸入窗口相比，一个完整的肺8的条件下引入伪像。此外，封闭胸程序，让胸廓基本完好承担保持原始状态的完好胸腔，比如对方的血流量的动态心肺运动相互影响的承诺。这些模型通常涉及与被缝合到胸壁15，或者被使得与肺表面直接接触，以防止组织9的干燥透明膜的窗口的帧。谈判心肺运动，以适应和使显微成像的困难是封闭胸腔程序的一个主要的技术挑战，并且可能负责该技术的低的总传播。在我们的例子中，该组合固体窗口保持框和一个Z向约束设备已被证明有效的，以充分地消除了肺的横向移动，以允许在一个封闭的胸窗10的肺循环的自动血流量测量。
一种常见的方法来测量从活体显微镜图像堆栈血流速度是利用在连续的图像的给定段的血管14的血流模式的空间匹配的。为了减少与单血管分析相关联的时间的努力，血流成像算法已被引入，产生整个光场11的血流速度的地图。除了时间上的优势，这种方法还允许在整个光电场血流的同时空间分析，不管血管形态或分支点的。研究肿瘤微环境，其中多个血管的重大贡献时，这是特别重要弼给定的肿瘤区13,16,17的供应状态。事实上，肿瘤脉管系统的曲折已知和大intervascular间隙的存在，可清楚地看到在该已经研究既转移性的癌症类型，（ 图2A）。肺窗口方法也已测试其能力报告改变血流速度在转移性病灶，通过测量最近已发现增加在肺循环血流速度的药物治疗的效果：高血压药麻黄素增加心输出量，而内皮素受体阻断剂ambrisentan减少预毛细管小动脉音调，这会导致，当药物在组合中给出，在肺毛细血管增加血流速度。虽然这些数据目前正在审查的其他部分，高血压药物的组合和能力的内皮素受体拮抗剂，以增加周边的肌肉灌注已独立18公布。而在正常情况下，血流速度的剂量依赖性增加，可以既注射后观察到的，但事实上，在第二次注射不会导致在肉瘤转移流速的进一步增加，可能会导致一个事实，即最大肿瘤血管舒张已经第一组合注射麻黄素和ambrisentan后已经达到。
以下限制适用于这里介绍的方法：本协议适用于大鼠（理论上，类似规模的哺乳动物）约180至300克以上。较小的哺乳动物，例如小鼠，需要特殊的修改，以适应肋骨的更加脆弱解剖学和生理学。可与所提出的技术来实现的最大空间分辨率理论上仅由物镜的数值孔径和所使用的盖滑动的厚度（〜0。08-0.1微米标准的品牌），以100倍的目标，配合使用油浸的。然而，在实践中，肺的剩余运动可能会限制使用高分辨率目标以外20X。如果肺的所有自主运动被消除，该技术的时间分辨率由摄像机的帧速率，以及荧光标记物，这决定了曝光时间的信号强度只限定，以每秒约100个帧。下面的附加限制适用于所呈现的技术：一方面，当前的微观和计算设置允许一个给定的转移表面的仅进行分析。使用深度穿透镜，如先进的共焦显微镜成像的策略，可能会在将来使血流速度的测量中3维。同时，所提出的方法不能以目前的形式，用于进一步可视化病变肺实质内。一个GLA的第三，插入与活跃的血管直接接触SS窗口有一些潜在的，或通过影响局部温度扰动本身的微血管血流，经血管的空间压缩。第四，在肺中使用的外部呼吸机和正压力也有可能会改变肺血液微循环。此外，肋条笼形件只限于领域是用于描述的，相对简单的外科手术几乎访问。肺表面的其他区域，如内侧 - 腹侧或背侧访问将需要更复杂的外科手术技术，沿与肋笼的生物力学的深刻扰动。因为缺乏替代显微成像研究血液微循环的，主要发展可以在不久的将来，以克服这些障碍，学习恶性肿瘤在高时空分辨率的啮齿动物肺的所有部分可以预期的。
总之，一种方法是PRESented测量的模式，并改变，在大鼠肺表面转移微血管血流速度。结合一种急性闭胸外科模型与测量血流速度，在整个微观光学领域的自动化方法，这种技术提供了肺的生理环境的相对保存，能够检测变化整体微循环血流的速度和方向，并且相对容易使用。可以预期，这一技术将是很有用处的该研究肺转移和其它动态过程的微循环中在啮齿动物模型中这种疾病的设置的所有组。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
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