Summary
Innføring av små molekyler til utvikling av Drosophila embryo gir store muligheter for karakterisering av biologiske aktivitet av nye forbindelser, legemidler og toksiner, samt for sondering grunnleggende utviklingsforløp. Metoder som er beskrevet her skissere fremgangsmåte som overvinne naturlige barrierer for denne tilnærmingen, utvider nytten av Drosophila embryo-modellen.
Abstract
Drosophila embryo har lenge vært en kraftig laboratoriemodell for å belyse molekylære og genetiske mekanismer som styrer utviklingen. Den enkle genetiske manipulasjoner med denne modellen har fortrengt farmakologiske tilnærminger som er vanlig i andre dyremodeller og cellebaserte analyser. Her beskriver vi de siste fremskritt i en protokoll som muliggjør bruk av små molekyler til å utvikle bananflue embryo. Fremgangsmåten detaljer fremgangsmåte for å overvinne den impermeabilitet av eggeskallet og samtidig opprettholde embryo levedyktighet. Eggeskall permeabilization over et bredt spekter av utviklingsstadier er oppnådd ved anvendelse av en tidligere beskrevet d-limonen embryo permeabilization løsningsmiddel (EPS 1) og ved aldring embryoer ved redusert temperatur (18 ° C) forut for behandling. I tillegg er bruken av en far-rødt fargestoff (Cy5) som en permeabilization indikator som er beskrevet, som er kompatibel med nedstrøms applikasjoner som involverer standard røde og grønne fluorescent fargestoffer i levende og faste preparater. Denne protokoll kan anvendes på studier med bioaktive forbindelser til å sondere utviklingsmessige mekanismer samt for studier med sikte på å vurdere teratogen eller farmakologisk aktivitet av uncharacterized små molekyler.
Introduction
Drosophila embryo fortsetter å være en ledende modell for undersøkelse av grunnleggende mekanismer for utvikling to. Denne kraftige modellen er støttet av et bredt spekter av molekylærgenetiske verktøy som tillater manipulering av omtrent alle tenke genet til enhver tid punkt, og i løpet av noen utviklings organ. Den lille størrelsen, rask utvikling, og omfattende karakterisering av morfogenese av Drosophila embryo gjør det til en modell av valget for genetiske skjermer, hvorav mange har avdekket grunnleggende utviklingsforløp 3,4. Mange fenotyper i Drosophila embryo har vært preget og er lett tolkbare, ofte gir et middel til å identifisere underliggende molekylære genetiske mekanismene som er ansvarlig for en unormal egenskap.
Historisk har en brist på flua embryo modellen vært problemer med å innføre små molekyler til embryonale vev. Denne hindringen har stilt begrensninger på: 1) ossing kjente bioaktive små molekyler som prober for å avhøre utviklingsmessige mekanismer og 2) ved bruk av denne etablerte modellen for å evaluere teratogen eller farmakologisk aktivitet av uncharacterized små molekyler. Som en følge av dette er screening potensialet av flue embryo blitt lite brukt i karakteriseringen av små molekyl-aktivitet.
Levering av små molekyler til å fly embryo kan oppnås med to metoder: 1) permeabilization av eggeskallet og 2) mikroinjeksjon. Denne artikkelen presenterer forskudd til metoden ifølge permeabilization som er lett å gjennomføre i innstillingen av en konvensjonell Drosophila laboratorium. Det bør bemerkes at de senere fremskritt innen mikroinjeksjon metoder med MicroFluidics teknologi er også bidrar til fremgangsmåter for å innføre forbindelsene i embryo 5,6. Innføring molekyler til embryoet forhindres av et voksaktig lag av eggeskallet 7. Drosophila eggeskall består av fem lag. Frainnsiden og ut er de: vitelline membran, voksaktig lag, den indre chorionic lag, endochorion og exochorion åtte. De tre ytre lag chorionic kan fjernes ved kort emersion av embryoet i fortynnet blekemiddel, referert til som et trinn dechorionation. Den eksponerte voksaktig sjikt kan deretter bli kompromittert ved eksponering mot organiske oppløsningsmidler, slik som heptan og oktan 7,9, rende dechorionated embryo gjennomtrengelig, mens det forblir innkapslet i den underliggende vitelline membran. Men bruk av slike oppløsningsmidler innfører komplikasjoner på grunn av deres toksisitet og vanskeligheten med å regulere deres sterke permeabilizing handling, som begge har sterk negativ effekt på embryoet levedyktighet 9,10.
En fremgangsmåte for permeabilization ved hjelp av et preparat betegnes embryo permeabilization løsningsmiddel (EPS) har tidligere blitt beskrevet en. Dette oppløsningsmiddel består av d-limonen og plante-avledede surfaktanter som gjør det løsningsmiddel som misciblE med vannholdige buffere. Den lave toksisitet av d-limonen, og evnen til å fortynne oppløsningsmiddel til ønsket konsentrasjon, har gitt en effektiv metode for å generere permeable embryoer med høy levedyktighet en. Imidlertid er to endogene faktorer fortsatt å bringe begrensninger for anvendelsen. Først embryoer demonstrere heterogenitet i permeabilitet etter EPS behandling, selv når omsorg er tatt for å opprettholde tett utviklings iscenesettelse. For det andre, embryoer eldre enn ca åtte timer har vist seg vanskelig å permeabilize, konsistent med en hardere av eggeskallet som oppstår etter egglegging 11.
Beskrevet her er fremskritt i EPS-metoden at: 1) bistå i å identifisere og analysere nesten identisk permeabilized embryoer, selv etter fiksering og farging skritt har blitt henrettet og 2) gjør permeabilization av embryoer på slutten utviklings tidspunkter (> 8 timer, scene 12 år og eldre). Nærmere bestemt anvendelse av en langt-rødt fargestoff,Cy5 karboksylsyre, er beskrevet som fungerer som en permeabilitet indikator, som vedvarer i løpet av utvikling av embryo og etter formaldehydfiksering. I tillegg er det vist at oppdrett embryoer ved 18 ° C opprettholder eggeskallet i en EPS sensitive tilstand, slik at permeabilization av sent stadium embryoer (stadier 12-16).
Disse fremskrittene overvinne de tidligere nevnte begrensninger i EPS metodikk. Dette programmet vil derfor gi etterforskere med et middel for å innføre små molekyler av interesse for embryoet på forskjellige utviklings tidspunkter og samtidig opprettholde levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Flue kulturer, løsninger og Embryo håndtering enheter
- Forbered et bur kultur Drosophila. Plasser 500 + parring fluer ønsket belastning i en befolkning bur utstyrt med en 10 cm drue-agar plate og en flekk av gjær lime. Oppretthold-kultur i en 25 ° C fuktighetskontrollert inkubator. MERK: Cage kulturer krever en dag eller to av condition for å oppnå konsistente embryo legging mønstre. Drue plater med gjær lime skiftes en gang om morgenen og en gang om kvelden under condition.
- Forbered EPS. Varme løsninger av overflateaktive midler (kokamid-DEA og ethoxylert alkohol) ved 37 ° C. Pipetter 18 ml av d-limonen i en glass scintillasjonskyvette utstyrt med et lite rørestav. Pipetter 1 ml hver av de to overflateaktive midler (5% sluttkonsentrasjon av hver) til d-limonen. Bland godt og fjern oppsikt bar. Merk Denne stamløsning av EPS er god i omtrent 2 måneder ved romtemperatur. Løsningenmå varmes ved 37 ° C og virvles for å fullt ut oppløseliggjøre tensider før bruk. EPS og d-limonen bør lagres i en glassbeholder som de vil oppløse enkelte plast over tid.
- Forbered embryo dechorionation løsning, inkubator medier, fargestoff og stoff løsninger. Bland 25 ml av blekemiddel med 25 ml H 2 O og sted i grunt fat. Forbered endret grunn inkuberingsmediet (animasjonsprogrammet Poser) og animasjonsprogrammet Poser-T i henhold til tidligere oppskrift 1,12. Forbered Shields og Sang M3 cellekulturmedium og PBS i henhold til produsentens protokoll (se Materialer List). Forbered stamløsning av permeabilization fargestoff på 10 mM konsentrasjon i DMSO.
- Monter embryo-håndtering enheter og rekvisita:
- Forbered dechorionation og EPS behandling kurv (se figur 1A). Klipp av en 3 cm delen av en disponibel 50 ml polypropylen sentrifuge / kultur tube med en fintannet sag. Gjør sveiseoverflaten flush ved å gni den delen røret på sandpapir levdtil en stasjonær overflaten. Sveis rørstykket til Nitex nylon mesh ved smelting kanten av rørstykket over en flamme og å trykke på den mesh på en glassplate. Avkjøl og klippe av ekstra mesh. MERK: De stupbratte sider og bunn gir mulighet for rask og fullstendig skylling av av restblekemiddel og EPS på de respektive trinn. Sveise trinn skal utføres under en avtrekkshette.
- Forbered en utvikling kurv. Skjær av toppdelen av en 50 ml sentrifuge / kultur røret i flukt med kanten av hetten. Fjern og modifisere hetten ved å kutte ut en sentral åpning, og hakkene langs kanten, som vist i figur 1B. Skru lokket over mesh og på gjengene på avskåret rØrseksjonen og trim ekstra mesh. MERK: Lokket inneholder hakk i felgen som tillater diffusjon til bulk medium ved plassering i 60 mm reservoaret fatet (Figur 1B ').
- Forbered komponenter i et lysbilde kammer. Skjær en firkant av DO membran som er større ennraset kammeråpningen. Påføre et meget tynt lag av vakuumfett til innsiden kanten av åpningen. Fest DO membranen inn i åpningen tetting mot fett med låsringen. Trim overflødig DO membran ved å kutte den tilbake nær låsringen. MERK:. Spesifikasjoner for lysbildekammeret kan bli funnet i Kiehart et al 13 er Dette kammeret ikke er kommersielt tilgjengelig og krever tilpassede fabrikasjon av en maskin butikk.
2. Staging, Dechorionation, og EPS Behandling av embryo
- Staging embryoer ved tidsbestemt samling. Sett en frisk drue / gjær plate til fly kultur bur i AM. Tillat embryoer som skal legges i 1 time ved 25 ° C. Kast denne plate og erstatte med en frisk drue / gjær-plate for en etterfølgende embryo legging av 2 timer ved 25 ° C. Samle denne platen og legg i 18 ° C inkubator for videre utviklings iscenesettelse. MERK: 1 time for utvikling ved 25 ° C er lik 2 timers utviklingved 18 ° C. Virkningen av aldring ved 18 ° C sammenlignet med 25 ° C for å opprettholde EPS permeabilization i sent stadium embryo kan sees i figur 2.
- Dechorionation. Skyll forsiktig embryo ut av drue plate i mesh kurv ved hjelp av 25 ° C vann fra springen og en pensel. Skyll overflødig gjær bort fra embryoene i kurven under en svak strøm av vann fra springen. Fordyp kurven i 50% blekemiddel for 2 min. Vask embryoer grundig under en strøm av vann fra springen. MERK: forsiktig sprute blekemiddel løsning på embryoene midlertidig ved hjelp av en plast pipette. Mens to min er vanligvis tilstrekkelig for fullstendig dechorionation, bør denne inkubasjonstid sjekkes ved direkte undersøkelse og justeres tilsvarende. Oppretthold dechorionated embryoer i kurven nedsenket i vann fra springen og fortsette umiddelbart til EPS trinn.
- EPS Treatment
- Forbered seks 60 mm retter med ca 10 ml PBS i hver. Forbered EPS fortynning ved oppløsning av 75 mL EPS i 2,925 ml MBIM (01:40) i et 50 ml begerglass under omvirvling. Merk: En hvit emulsjon skjemaer fra denne blandingen.
- Blot overflødig vann fra bunnen av trådkurv med en lab tørke. Fordyp kurven i fortynnede EPS i begerglass og umiddelbart virvle å dispergere embryoer i EPS-løsning i bunnen av kurven. Fortsett virvlende bevegelse for 30 sek. MERK: EPS fortynninger og eksponeringstider kan varieres for å kontrollere permeabiliteten. Det anbefales at optimale EPS fortynninger og behandling ganger etableres empirisk med toner av fluer som blir brukt. Økende eksponeringstid til 60-90 sek er gunstig for scene 12 og eldre embryoer.
- Fjern kurv, blot bort overflødig EPS med en lab tørk. Fortsett med seks sekvensielle vaskinger i 10 ml PBS i 60 mm skåler. Bruk en plast pipette å forsiktig sprute embryoer med PBS i hver av de seks vasker. Fortsett å farge og narkotika behandlingstrinn. MERK: Kan kastes EPS av i vasken.
Tre. Dye and Drug Treatment of permeabilized embryo
- Dye Treatment
- Tilsett 5 ul av 10 mM Cy5 karboksylsyre fargestoff * til 1 ml av animasjonsprogrammet Poser-T (50 mM sluttkonsentrasjon) i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør og vortex å blande. MERK: * Valg av fargestoff avhenger nedstrøms analyse. Cy5 karboksylsyre er effektivt for senere analyser ved hjelp av fiksering og farging. Rhodamine B er nyttig for analyse av levende embryoer. Den røde emisjon av Rhodamine B, og den grønne utslipp av dens metabolitter 1, kan presentere noen komplikasjoner med nedstrøms applikasjoner ved hjelp av fluorescens. Medikament eller toksin kan tilsettes til fargeløsning for å initiere behandling på dette stadium, eller for å begrense medikament / toksin behandling til en puls på dette stadiet. Forsiktighet bør utvises for å håndtere og avhende legemidler og giftstoffer i henhold til HMS-datablad og sikkerhetsmiljøstandarder.
- Overfør embryoer fra mesh kurv til fargestoff løsning ved hjelp av en pensel. Lokk på røret, og inverteres gjentatte ganger for å sikre atembryoer flyte fritt i suspensjon i fargestoffoppløsningen. Plasser røret på en vippende vippe i 15 min ved romtemperatur.
- Fjern røret fra nutator og la embryoer bosette. Fjern fargeløsning med en fin pipette og erstatte med en ml av animasjonsprogrammet Poser-T for å vaske. Vend røret for å re-suspendere embryoer helt. La embryoer bosette og gjenta med tre animasjonsprogrammet Poser-T vasker. Fjern alle animasjonsprogrammet Poser-T fra siste skylling og fortsett til inkuberingstrinnet.
- Inkubasjon for Embryo Utvikling
- Overfør embryo til en av to kamre: Utviklingen kurv eller lysbildekammeret. MERK: Utviklingen kurv er å foretrekke for lengre utviklings perioder, og er nødvendig dersom etterfølgende fiksering og farging skritt er å bli henrettet. Raset kammeret er optimal for høyere oppløsning time-lapse bildebehandling og er mest effektive for korte utviklings perioder (f.eks de tidlige embryonale hendelser). Medikament eller toksin kan tilsettes til mediumet i forskjellige konsentrasjoner og embryo development kan overvåkes i sanntid med levende embryoer eller ved et endepunkt ved hjelp av standard fiksering og farging protokoller.
- Utvikling i Baskets
- Rengjør en utvikling kurv ved squirting med 70% etanol, skyll grundig med de-ionisert vann og tørk tørt med lab tørk. Forbered 6 ml inkuberingsmediet med ønsket konsentrasjon av narkotika eller gift. Plasser utvikling kurv i medium i 60 mm fatet ta vare å ikke felle luftbobler under mesh base. MERK: To media blir ofte brukt: animasjonsprogrammet Poser alene, eller MBIM/M3 i en 50:50 blanding, sistnevnte er mer effektivt for lengre utviklingstid.
- Overfør permeabilized embryoer til mesh overflaten i bunnen av kurven med en pensel. Forsiktig sprute embryoene med media fra den omkringliggende reservoaret. Disperse embryoene med pensel, slik at de er i et monosjikt på nettingen. MERK: Fortsett til mikroskopi bildebehandling og evaluere permeabilization og levedyktighet egenskapene til preparation (se trinn 4).
- Utvikling i lysbilde Chamber
- Vend lysbilde kammer og bruke en liten perle av vakuum fett på omkretsen av åpningen. Sett 150 ul medium med ønsket mengde medikament eller toksin på overflaten av DO membran inne i åpningen. MERK: To media blir ofte brukt: animasjonsprogrammet Poser alene, eller MBIM/M3 i en 50:50 blanding, sistnevnte er mer effektivt for lengre utviklingstid.
- Overfør permeabilized embryoer til slipp av media med en pensel. Spre embryoene gjør dem bosette seg på membranen i drop.
- Anvende en 25 mm sirkulær dekk forsiktig over åpningen og dermed flate mediet. Trykk forsiktig ned langs ytterkanten av dekkglass for å danne en tetning med fett. MERK: Fortsett til mikroskopi bildebehandling for å evaluere permeabilization og levedyktighet egenskapene til preparatet (se trinn 4).
4. Identifiseringen av permeabilized Levedyktige embryo
- Identifiser permeabilized embryoer. Observer embryoer henhold epifluorescence med et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Acquire bilder (i blå bølgelengde å bestemme profilen plomme autofluorescence) av flere felt med faststående mikroskop og kamerainnstillinger.
- Bestem permeabilization av embryoer basert på relativ fluorescens intensitet. Bruk en stereomikroskop med en stor arbeidsavstand for å imøtekomme kurven og å tillate manipulasjoner av embryoene. Mikroskopet skal være utstyrt med en programmerbar XYZ scenen, epifluorescence belysning og et digitalt kamera. Bilde embryoene som tar vare å ta eksponering og scene posisjonsrammer for hvert embryo bildet for å muliggjøre re-evaluering av de samme embryo på et senere tidspunkt (se representativt resultat i figur 3). MERK: Mønstre av fargestoffopptaket, vil variere avhengig av fargestoff som brukes, lengden på eksponeringen og embryo alder. Et bredt utvalgav fargestoffopptaket på tvers av et enkelt preparat er typisk og reflekterer variasjoner i graden av permeabilization.
- Identifiser levedyktige embryoer. Etter merking stilling permeabilized embryoer, fortsett med embryo utvikling ved romtemperatur eller 25 ° C. Returnere kurv eller lysbilde kammer til mikroskop. Observere under blå kanalen fluorescens og skaffe bilde av plomme autofluorescence i tidligere identifiserte permeabilized embryoer. Vurdere levedyktigheten i henhold til normale progresjon av eggeplomme fordeling (se Rand et al. 1 og representativt resultat i figur 3). MERK: Andre morfologiske trekk ved embryoet observert med lysfelt mikroskopi kan brukes til å vurdere levedyktighet. Det anbefales å etablere graden av permeabilitet som er kompatibel med levedyktighet bestemmes empirisk for hver fargestoff og belastning av fly benyttes.
- Vurdere narkotika eller giftvirkninger i permeabilized levedyktige embryoer.
- Embryoer prosessed med ovennevnte protokoll er klar for en rekke konvensjonelle analyser etter at medikamentet eller toksinet eksponering. Flere av de ulike typer analyser anses i diskusjonen under og inkludere direkte observasjon av morfogenese i levende embryoer samt post-fiksering farging analyser. Begge disse metodene er forbedret ved bruk av vitale fargestoffer (f.eks GFP) som avslører genuttrykk mønstre og celle avstamning og morfologi profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryo håndtering enheter er avbildet i figur 1 for å bistå i å visualisere de "hjemmelagde" enheter for manipulasjon i de ovennevnte protokoller. Resultater sett i Figur 2 illustrerer robust effekt av oppdragelse embryoer ved 18 ° C på deres evne til å bli permeabilized av EPS på sene stadier av utviklingen. Denne tilstanden er brukt i protokollen trinn 2.1. Effekten av Cy5 karboksylsyre fargestoff for å avdekke de forskjellige nivåer av permeabilitet typisk sett i EPS-behandlede embryoer er sett i figur 3. Den utviklingsmessige dynamikken i fordelings fargestoff i eggeplomme er også sett i figur 3, og viser et kriterium for å vurdere levedyktigheten , som beskrevet i protokoll trinn 4.2. Nytten av Cy5 fargestoff for å bestemme embryo permeabilization følgende til toksin-behandling, formaldehydfiksering og farging er illustrert ved resultatene i figur 4.
Figur 1. Embryo håndtering enheter for EPS-metoden. Den flatbunnet kurv brukes i dechorination og EPS trinn eksponering (A, A '). Utviklingen kurven anvendes for lengre utviklingsmessige eksponeringer av permeabilized embryo (B, B '). Raset kammeret blir brukt for kortere utviklings eksponeringer og høyere oppløsning avbildning av levende embryoer (C, C '. Se teksten for nærmere beskrivelse).
Figur 2. Effekt av aldring ved 18 ° C på EPS-effekt i sent stadium embryoer. Embryoer ble oppsamlet i to timer etterfulgt av aldring ved 18 ° C i 20 timer (Paneler AA "?
Fig. 3. Inkorporering av Cy5 i permeable og levedyktige embryoer. Embryoer ble oppsamlet ved 25 ° C i 2 timer og eldet i 14 timer ved 18 ° C (tilsvarende 7-9 hr embryoer ved 25 ° C, trinn 12). Etter dechorination, EPS-behandling ble gjort (01:40 i animasjonsprogrammet Poser i 1 min), etterfulgt av inkubasjon i Cy5 fargestoff (50 uM i animasjonsprogrammet Poser-T i 15 min). Embryoer ble vasket tre ganger i animasjonsprogrammet Poser-T og overført til utviklingskurven med animasjonsprogrammet Poser i reservoaret. Utvikling ble tillatt å proceed i 8 timer ved romtemperatur. Opptak av Cy5 (Red) er fotografert i langt-rød kanal umiddelbart etter fargestoff behandling og vasking (panel A) og etter 8 timers utvikling (Panel B). Fordeling av plommen er sett av autofluorescence i den blå kanalen. Dye opptak, derav permeabilitet, er sett til å variere fra embryo til embryo. Cy5 fargestoff (rødt) er sett til å lokalisere til eggeplomme (blå), som blir konsentrert til lumen i tarmen ved stadium 16 (lilla, B panel).
Figur 4. Fastsettelse av permeabilization og metylkvikksølv effekter i anleggs og immunostained embryoer. Embryoer ble oppsamlet ved 25 ° C i 2 timer og eldet i 14 timer ved 18 ° C (tilsvarende 7-9 hr embryoer ved 25 ° C, trinn 12). Etter dechorination ble EPS behandling gjort (01:40 i animasjonsprogrammet Poser i 1 min), etterfulgt av inkubasjon iCy5 fargestoff (50 uM i animasjonsprogrammet Poser-t i 15 minutter) sammen med metylkvikksølv (50 uM MeHg, panel B) eller DMSO, løsningsmiddel-kontroll (0,1% sluttkonsentrasjon, panel A). Embryoer ble vasket med animasjonsprogrammet Poser-T og plassert i en utviklingskurven med animasjonsprogrammet Poser: M3 medium i reservoaret og eldet i ytterligere 8 timer ved romtemperatur. Embryoer ble deretter fiksert i en to-fase 4% paraformaldehyd-heptan forberedelse av en standard protokoll 14.. Farging ble utført med anti-Fasciclin II (grønn i A, B og hvitt i A ', B') til å merke motoriske nevroner og anti-elav antistoffer (rød i A, B) for å merke alle nevron celle organer. Cy5 fargestoff er avslørt ved direkte fluorescens, som krever utvidet eksponering på grunn av redusert fluorescens intensitet på grunn av fiksering (Cy5 er pseudo-farget blått i alle paneler). Virkningene av MeHg er sett i den uregelmessige mønster og clustering av de laterale chordotonal nevron celle organer (elav-positive, merket i rødt og er merket med hvite piler i B versus A). I tillegg er en karakteristisk forgrening i segmenter (SN) (heltrukne grønne piler i A ') sett til å være svært variabel med MeHg eksponering (skraverte grønne piler i B ") var i overensstemmelse med tidligere rapporterte effekter av MeHg på embryoet 15.. Projeksjon av intersegmental og segment nerver på sine røtter er sett til å bli fortrengt posteriorly med MeHg eksponering (åpen grønn pil i B '). Merk: Metylkvikksølv er en sterk nervegift. Forsiktighet bør utvises for å bruke hansker og vernebriller ved håndtering. Deponering bør gjøres gjennom en institusjonell miljøsikkerhet anlegg og service.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovennevnte fremgangsmåte beskriver et middel for å oppnå levedyktige Drosophila embryo som er tilgjengelige for små molekyl-behandlinger over et bredt utviklingsområde. Denne metoden introduserer romanen og enkle funn at aldring embryoer ved 18 ° C gjør permeabilization av sent stadium embryo med samme effekt som tidligere bare sett i tidlig stadium embryoer. I tillegg har bruken av far-rødt fargestoff Cy5 karboksylsyre som en permeabilitet indikator vist seg effektive i post-fastsette programmene og ikke forstyrrer vanlige røde og grønne fluorescerende markører som kan brukes for å avsløre utviklingsmessige fenotyper. Disse funnene betydelig fremme effekten og nytten av EPS-metoden.
Denne metoden er mottagelig for analyser av både levende og faste embryo forberedelser. Bruke lysfelt mikroskopi og lysbildet kammeret satt opp, typiske trekk for å score i den første halvdelen av embryo utvikling er morphogenetic bevegelsercellularization av blastoderm, cephalic fure formasjon, germband tøyelighet og germband tilbaketrekking en. Med GFP eller RFP reportere mer spesifikke endepunkter kan fanges opp, f.eks tidlig segmentering mønstre og dannelsen av nevrale strukturer i senere utvikling en. GFP og RFP rapporter også aktivere observasjon av utviklingsmessige hendelser i levende permeabilized embryoer i både lysbildet kammeret og utviklings kurv forberedelser. En enkel metode for å bestemme total toksisitet av en anvendt medikament eller kjemisk er å overvåke mønster av plommeprotein auto-fluorescens i den blå kanalen for å bestemme en forsinkelse eller opphør av utvikling av en.
EPS-metoden har også et stort potensial for å utvide undersøkende verktøy for ikke-modell insekter, spesielt mygg, som deler en lignende arkitektur av eggeskallet. Bruk av små molekyler til embryoer fra andre insektarter ville åpne opp en allé av undersøkelsesaktipå hvor vanlige genetiske tilnærminger til funksjonelle studier er for tiden mangler. Embryo utviklet seg i kurver kan behandles for formaldehyd fiksering, derfor åpner opp analyser til den brede utvalg av farging reagenser tilgjengelige for Drosophila studier. Imidlertid krever dette trinnet at en post-fix fastsettelse av permeabilization være mulig å korrelere fenotyper med embryoer som hadde blitt gjort tilgjengelig for stoffet. Anvendelse av Cy5 karboksylsyre fargestoff har vist seg svært effektiv for denne tilnærmingen. Cy5 karboksylsyre blir effektivt tatt opp i permeabilized embryoer (figur 3A). Under utviklingen Cy5 er konsentrert i eggeplomme, som til slutt trukket i lumen av formings tarmen ved trinn 14 og senere (figur 3B). Etter fiksering, er Cy5 fluorescens markert redusert, men pålitelig påvises i tarmen og fungerer som en markør for disse embryoer som ble effektivt permeabilized i utgangspunktet (se representative result Figur 4). Det bør bemerkes at Cy5 deteksjon på dette stadiet krever lengre kamera eksponeringer (f.eks, 1-4 sekunder) for deteksjon. Således kan scoring av fenotyper med farging mønster fortsetter ved hjelp av Cy5 signal for å bekrefte tilsvar permeabilized embryoer sammen med vev-spesifikke markører (f.eks neurale spesifikke antistoffer sett i figur 4).
Den største utfordringen i denne metoden er følsomheten av embryo levedyktighet til permeabilization prosessen, noe som lenge har plaget tidligere forsøk på å utvikle denne metoden 9,10,16. Levedyktighet etter at permeabilization er tydelig aldersavhengig, og øker dramatisk jo eldre fosteret er over permeabilization ni. Likevel, som vi har vist tidligere, blir permeabilitet stadig vanskeligere med alderen ett. En fersk rapport viser nå muligheten til å permeabilize sent stadium embryoer (stadium 14) ved å re-påkalle heptane som et oppløsningsmiddel i forbindelse med d-limonen 17. Den brede nytten av denne siste metoden er ikke klar som bare ett medikament effekt ble karakterisert (nocodazole) og søknad til tidligere stadium embryoer ble ikke beskrevet 17. Videre unngår anvendelsen av 18 ° C utvikling trinn som er beskrevet ovenfor utbytter sent stadium permeabilitet og videre bruk av toksiske organiske løsningsmidler. Etterforskeren som er ny i EPS-protokollen vil oppleve variasjon i permeabilization og levedyktighet utfall ved første gangs forsøk. Fremgangsmåten her gi etterforskeren verktøy for å systematisk variere vilkår permeabilization behandlinger og påfølgende ruge skritt for å optimalisere forholdene for spesifikke stammer av Drosophila de arbeider i sitt eget laboratorium innstilling.
En ytterligere utfordring med metoden er variasjonen i kjemisk binding sett fra embryo til embryoet. Denne variasjonen er reflektert i den heterogeneCy5 fargestoff opptak sett i embryoer umiddelbart etter fargestoff behandling (figur 3A). I kontrast, er Rhodamine B fargestoff raskere og jevnere fordelt over de embryonale vev enn Cy5 fargestoff (figur 2B "). Således kan noe av embryo-til-embryo variabilitet kan det inneholdes i fordelingsegenskapene til kjemiske, legemiddel eller toksin av interesse og er iboende i fremgangsmåten. Der kvantifisering av dosen er kritisk, anbefales det at opptak av medikamentet eller toksinet av interesse er karakterisert ved en alternativ analysemetode. Ikke desto mindre gjør det mulig å lette den ovennevnte protokoll, og evnen til å screene hundrevis av embryoer, undersøkeren å evaluere dose-reaksjoner og scorer karakteristiske fenotyper med liten investering av ressurser, og for en kraftig første tilnærming for å karakterisere legemidler eller toksiner i dette høyt utviklet modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
