Summary
Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell'attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l'utilità del modello di embrione di Drosophila.
Abstract
L'embrione di Drosophila è stato a lungo un potente modello di laboratorio per chiarire i meccanismi molecolari e genetici che controllano lo sviluppo. La facilità di manipolazioni genetiche con questo modello ha soppiantato approcci farmacologici che sono comuni in altri modelli animali e saggi cellulari. Qui descriviamo i recenti progressi in un protocollo che consente l'applicazione di piccole molecole per la mosca della frutta in via di sviluppo dell'embrione. Il metodo dettagli passi per superare l'impermeabilità del guscio, pur mantenendo la vitalità dell'embrione. Guscio d'uovo permeabilizzazione attraverso una vasta gamma di stadi di sviluppo si ottiene con l'applicazione di una precedentemente descritto d-limonene embrione permeabilizzazione solvente (EPS 1) e gli embrioni di invecchiamento a temperatura ridotta (18 ° C) prima di trattamenti. Inoltre, l'uso di un colorante rosso lontano (CY5) come indicatore di permeabilizzazione è descritto, che è compatibile con le diverse applicazioni che coinvolgono influenza rosso e verde di seriecoloranti orescent in preparazioni dal vivo e fissi. Questo protocollo è applicabile a studi utilizzando composti bioattivi per sondare meccanismi di sviluppo e per gli studi volti a valutare l'attività teratogena o farmacologica di uncharacterized piccole molecole.
Introduction
L'embrione Drosophila continua ad essere un modello di primo ministro per studio dei meccanismi fondamentali dello sviluppo 2. Questo potente modello è supportato da una vasta gamma di strumenti genetici molecolari che permettono manipolazioni essenzialmente qualsiasi gene in qualsiasi punto nel tempo e all'interno di qualsiasi organo in via di sviluppo. Le dimensioni ridotte, rapido sviluppo, e ampia caratterizzazione della morfogenesi di Drosophila ne fanno un modello di scelta per schermi genetici, molti dei quali hanno scoperto percorsi di sviluppo fondamentali 3,4. Numerosi fenotipi in Drosophila sono stati caratterizzati e sono facilmente interpretabili, spesso fornendo un mezzo per identificare meccanismi genetici molecolari sottostanti responsabili di un tratto anormale.
Storicamente, una lacuna del modello embrione fly è stata la difficoltà di introdurre piccole molecole ai tessuti embrionali. Questo ostacolo ha posto limitazioni: 1) ciing conosciuti piccole molecole bioattive come sonde per interrogare meccanismi di sviluppo e 2) con questo modello istituito per valutare l'attività teratogena o farmacologica di non caratterizzate piccole molecole. Di conseguenza, il potenziale di screening della mosca embrione è stato sufficientemente sfruttato nella caratterizzazione di piccola attività molecola.
Consegna di piccole molecole per la mosca embrione può essere realizzato con due metodi: 1) permeabilizzazione del guscio e 2) microiniezione. Questo articolo presenta anticipi al metodo di permeabilizzazione che sono facili da eseguire nel contesto di un laboratorio tradizionale Drosophila. Va notato che i recenti progressi nei metodi microiniezione con tecnologia microfluidica contribuisce anche ai metodi di introdurre composti al 5,6 embrione. Introducendo molecole per l'embrione è impedito da uno strato ceroso del guscio 7. Il guscio Drosophila è costituito da cinque strati. Dal'esterno che sono: la membrana vitellina, lo strato ceroso, lo strato interno corionica, il endochorion e il exochorion 8. I tre strati corionica esterni possono essere rimossi breve emersione dell'embrione in candeggina diluita, un passo indicato come dechorionation. Lo strato ceroso esposto può essere compromesso dall'esposizione ai solventi organici, come eptano e ottano 7,9, rendendo l'embrione dechorionated permeabile, mentre rimane racchiusi nella membrana vitellina sottostante. Tuttavia, l'uso di tali solventi introduce complicazioni dovute alla loro tossicità e la difficoltà di regolare la loro forte azione permeabile, entrambi i quali hanno effetti negativi Stark vitalità dell'embrione 9,10.
Un metodo di permeabilizzazione utilizzando una composizione definita embrione permeabilizzazione solvente (EPS) è stato descritto in precedenza 1. Questo solvente costituito da d-limonene e tensioattivi di origine vegetale che consentono il solvente sia miscibldi e con tamponi acquosi. La bassa tossicità di d-limonene e la capacità di diluire il solvente a concentrazioni desiderate ha dato un metodo efficace per generare embrioni permeabili con alta vitalità 1. Tuttavia, due fattori endogeni hanno continuato a portare limitazioni all'applicazione. In primo luogo, gli embrioni dimostrano l'eterogeneità della permeabilità dopo il trattamento EPS, anche se si ha cura di mantenere una stretta messa in scena dello sviluppo. In secondo luogo, gli embrioni più vecchio di circa otto ore hanno dimostrato difficile da permeabilize, coerente con un indurimento del guscio che si verifica dopo la deposizione delle uova 11.
Descritto qui ci sono progressi nel metodo EPS che: 1) contribuire a individuare e analizzare gli embrioni quasi identico permeabilizzate, anche dopo il fissaggio e di immunoistochimica passi sono stati eseguiti e 2) consentire permeabilizzazione degli embrioni in punti ritardo dello sviluppo tempo (> 8 ore, palcoscenico 12 anni e più). In particolare, l'applicazione di un colorante rosso lontano,Acido carbossilico CY5, è descritto che funge da indicatore permeabilità, che persiste nell'embrione durante lo sviluppo e dopo fissazione con formaldeide. Inoltre, è dimostrato che l'allevamento embrioni a 18 ° C mantiene il guscio in uno stato sensibile EPS, consentendo permeabilizzazione di embrioni fase tardiva (fasi 12-16).
Questi progressi superare i limiti precedentemente menzionati alla metodologia EPS. Questa applicazione sarà quindi fornire agli investigatori un mezzo per introdurre piccole molecole di interesse per l'embrione in diversi momenti dello sviluppo, pur mantenendo la redditività.
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Protocol
1. Preparazione delle Culture Fly, soluzioni e dispositivi Embryo Handling
- Preparare una cultura gabbia di Drosophila. Mettere 500 + accoppiamento in linea del ceppo desiderato in una gabbia di popolazione dotata di una piastra di uva-agar 10 centimetri e un po 'di lievito in pasta. Mantenere la cultura in un incubatore controllata di 25 ° C umidità. Nota: Culture Cage richiedono un giorno o due di condizionamento per ottenere modelli di embrione posa coerenti. Piastre di uva con lievito in pasta vengono cambiati una volta al mattino e una la sera durante il condizionamento.
- Preparare EPS. Le soluzioni caldi di tensioattivi (cocamide DEA e alcool etossilati) a 37 ° C. Pipettare 18 ml di d-limonene ad una fiala di scintillazione in vetro munito di una piccola ancoretta. Pipettare 1 ml ciascuno dei due tensioattivi (concentrazione finale 5% di ciascuna) al d-limonene. Mescolare accuratamente e rimuovere ancoretta. NOTA: Questa soluzione stock di EPS è un bene per circa 2 mesi a temperatura ambiente. La soluzionedeve essere riscaldato a 37 ° C e agitato in modo da solubilizzare completamente tensioattivi prima dell'uso. EPS e d-limonene devono essere conservati in un contenitore di vetro in quanto saranno sciogliere alcune plastiche nel tempo.
- Preparare una soluzione embrione dechorionation, medium di incubazione, tintura e soluzioni di droga. Miscelare 25 ml di candeggina con 25 ml di H 2 O e mettere in un piatto poco profondo. Preparare mezzo modificato di base di incubazione (MBIM) e MBIM-T secondo la prima ricetta 1,12. Preparare Shields e Sang M3 terreno di coltura cellulare e PBS secondo il protocollo del produttore (vedi Materials List). Preparare soluzione stock di permeabilizzazione colorante a 10 mM di concentramento in DMSO.
- Montare dispositivi embrione di gestione e forniture:
- Preparare dechorionation e cestino trattamento EPS (vedi Figura 1A). Tagliare una sezione di tre centimetri di un usa e getta polipropilene da 50 ml centrifuga / provetta di coltura con una sega a denti fini. Rendere la superficie a filo di saldatura strofinando la sezione del tubo su carta vetrata aderitoad una superficie da banco. Saldare la sezione del tubo di maglia di nylon Nitex fondendo il bordo della sezione di tubo a fuoco e premendo a maglia su una lastra di vetro. Lasciate raffreddare e tagliare a rete supplementare. NOTA: I lati a strapiombo e inferiore consentono un rapido e completo risciacquo di candeggina residua e EPS alle rispettive fasi. Le fasi di saldatura devono essere effettuate sotto una cappa aspirante.
- Preparare un cesto di sviluppo. Tagliare porzione superiore di una centrifuga da 50 ml / provetta di coltura a filo con il bordo del tappo. Rimuovere e modificare il tappo tagliando un'apertura centrale e tacche lungo il bordo come mostrato nella Figura 1B. Avvitare il tappo sulla maglia e sui fili della sezione del tubo tagliato e tagliare maglia supplementare. NOTA: Il tappo contiene tacche nel bordo che consente al mezzo di diffusione di massa quando posizionato nel piatto serbatoio 60 mm (Figura 1B ').
- Preparare componenti di una camera di scorrimento. Tagliare un quadrato di membrana DO che è maggiore dil'apertura camera di scorrimento. Applicare uno strato molto sottile di grasso per vuoto al labbro interno dell'apertura. Fissare la membrana DO nell'apertura tenuta contro il grasso con l'anello di fermo. Tagliare l'eccesso di membrana DO tagliando di nuovo vicino al l'anello di fermo. NOTA:. Specifiche per la camera di scorrimento si possono trovare in Kiehart et al 13 Questa camera non è disponibile in commercio e richiede fabbricazione su misura da un negozio di macchina.
2. Staging, Dechorionation, e trattamento EPS di embrioni
- Messa in scena embrioni per collezione temporizzata. Impostare un piatto d'uva / lievito fresco alla gabbia cultura mosca al mattino. Consentire embrioni da posare per 1 ora a 25 ° C. Scartare questa piastra e sostituirla con una piastra uva / lievito fresco per una successiva posa embrione di 2 ore a 25 ° C. Raccogliere questa piastra e il luogo in 18 ° C incubatore per ulteriore messa in scena dello sviluppo. NOTA: 1 h di sviluppo a 25 ° C è pari a 2 ore di sviluppoa 18 ° C. L'effetto di invecchiamento a 18 ° C rispetto a 25 ° C sul mantenimento EPS permeabilizzazione embrioni in fase avanzata può essere visto in Figura 2.
- Dechorionation. Lavare delicatamente gli embrioni fuori del piatto uva nel paniere mesh con 25 ° C acqua di rubinetto e un pennello. Sciacquare lievito in eccesso dagli embrioni nel cestino sotto una leggera corrente di acqua del rubinetto. Immergere il cestello nel 50% di candeggina per 2 min. Lavare gli embrioni accuratamente sotto un getto di acqua del rubinetto. NOTA: spruzzare delicatamente soluzione di candeggina sulle embrioni intermittenza con una pipetta di plastica. Mentre 2 min è solitamente sufficiente per una completa dechorionation, questo tempo di incubazione deve essere controllato da un esame diretto e adeguato di conseguenza. Mantenere gli embrioni dechorionated nel paniere immerso in acqua di rubinetto e procedere immediatamente alla fase EPS.
- Trattamento EPS
- Preparare sei piatti 60 millimetri con circa 10 ml di PBS in ciascuna. Preparare la diluizione EPS sciogliendo 75 microlitri EPS a 2.925 ml MBIM (01:40) in un bicchiere da 50 ml in vetro con vorticoso. Nota: Una forma di emulsione bianchi di questa miscela.
- Tamponare l'acqua in eccesso dal fondo del cestello in rete con un laboratorio pulire. Immergere basket in EPS diluiti in coppa e immediatamente agitare per disperdere gli embrioni nella soluzione EPS nel fondo del cestello. Continua vorticoso movimento per 30 sec. NOTA: EPS diluizioni e tempi di esposizione possono essere variate per controllare la permeabilità. Si raccomanda che ottimali EPS diluizioni e tempi di trattamento stabiliti empiricamente con i ceppi di mosche in uso. Aumentare il tempo di esposizione di 60-90 secondi è favorevole per la fase 12 ed embrioni anziani.
- Rimuovere cestino, asciugare lontano eccesso EPS con un laboratorio pulire. Procedere con sei lavaggi sequenziali in 10 ml di PBS nei piatti 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di plastica a schizzare delicatamente gli embrioni con PBS in ciascuna delle sei lavaggi. Procedere per tingere e fasi di trattamento della droga. Nota: EPS possono essere smaltiti nel lavandino.
3. Dye and Drug trattamento di permeabilizzate embrioni
- Dye Trattamento
- Aggiungere 5 ml di 10 mM CY5 carbossilico acido colorante * a 1 ml di MBIM-T (50 mM concentrazione finale) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. NOTA: * La scelta di colorante dipende l'analisi a valle. L'acido carbossilico CY5 è efficace per le successive analisi che utilizzano la fissazione e immunoistochimica. Rodamina B è utile per l'analisi di embrioni viventi. L'emissione rossa di rodamina B, e l'emissione verde dei suoi metaboliti 1, possono presentare alcune complicazioni con applicazioni a valle che utilizzano la fluorescenza. Farmaco o tossina possono essere aggiunti alla soluzione colorante di iniziare il trattamento, in questa fase, o limitare il trattamento farmaco / tossina di un impulso in questa fase. Si deve prestare attenzione per gestire e smaltire farmaci e tossine in base alle scheda di sicurezza e gli standard di sicurezza ambientale.
- Trasferire embrioni dal cestello a rete per la soluzione colorante con un pennello. Chiudere la provetta e invertire ripetutamente per assicurare laembrioni fluttuare liberamente in sospensione nella soluzione colorante. Mettere tubo su una sedia a dondolo oscillante per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il tubo da nutator e lasciare che gli embrioni si depositano. Rimuovere la soluzione colorante con un bel pipetta e sostituirlo con 1 ml di MBIM-T da lavare. Capovolgere il tubo di ri-sospendere completamente embrioni. Lasciate embrioni stabilirsi e ripetere con più di tre lavaggi MBIM-T. Rimuovere tutti MBIM-T da risciacquo finale e procedere alla fase di incubazione.
- Incubazione per lo sviluppo dell'embrione
- Trasferire embrioni ad una delle due camere: Il cestino sviluppo o della camera di scorrimento. NOTA: Il cestino di sviluppo è preferito per lunghi periodi di sviluppo, ed è necessaria se le successive fasi di fissazione e di immunoistochimica devono essere eseguiti. La camera di scorrimento è ottimale per una maggiore risoluzione time-lapse imaging ed è più efficace per brevi periodi di sviluppo (ad esempio, gli eventi precoci embrionali). Farmaco o tossina possono essere aggiunti al mezzo a varie concentrazioni e embrione dviluppo può essere monitorato in tempo reale con embrioni vivi o su un endpoint mediante fissaggio standard ed immunoistochimica protocolli.
- Sviluppo in cestini
- Pulire un cesto di sviluppo spruzzando con il 70% di etanolo, sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata e asciugare con il laboratorio pulire. Preparare 6 ml di medium di incubazione con concentrazione desiderata di farmaco o tossina. Posizionare il cestello sviluppo in media 60 millimetri di presa piatto attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto la base della maglia. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest'ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo.
- Trasferire gli embrioni permeabilizzate ad ingranare superficie di base del paniere con un pennello. Spruzzare delicatamente gli embrioni con i media dal serbatoio circostante. Disperdere gli embrioni con il pennello in modo che siano in un monostrato sulla mesh. Nota: Procedere con immagini di microscopia e valutare permeabilizzazione e vitalità caratteristiche del preparation (vedi punto 4).
- Sviluppo alla Camera diapositive
- Invertire camera di scorrimento e applicare una piccola quantità di grasso per vuoto sul perimetro dell'apertura. Porre 150 ml di terreno con la quantità desiderata di farmaco o tossina sulla superficie della membrana DO all'interno dell'apertura. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest'ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo.
- Trasferire gli embrioni permeabilizzate al calo di media con un pennello. Disperdere gli embrioni che li depositano sulla membrana all'interno della goccia.
- Coprire delicatamente un coprioggetto circolare di 25 mm l'apertura appiattendo così il mezzo. Premere delicatamente verso il basso lungo il perimetro del vetrino per formare un sigillo con il grasso. Nota: Procedere alla microscopia imaging per valutare la permeabilizzazione e vitalità caratteristiche della preparazione (vedi punto 4).
4. Identizione di permeabilizzate embrioni vitali
- Identificare gli embrioni permeabilizzate. Osservare gli embrioni sotto epifluorescenza con un microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale. Acquisire le immagini (in lunghezza d'onda blu per determinare il profilo tuorlo autofluorescenza) di diversi campi utilizzando microscopio fisso e le impostazioni della fotocamera.
- Determinare permeabilizzazione di embrioni basato sull'intensità di fluorescenza relativa. Utilizzare uno stereomicroscopio con una grande distanza di lavoro per accogliere il carrello e consentire manipolazioni degli embrioni. Il microscopio deve essere dotato di una fase programmabile XYZ, illuminazione epifluorescenza e una fotocamera digitale. Immagine embrioni avendo cura di registrare l'esposizione e parametri di posizione fase di ogni immagine embrione per consentire la rivalutazione degli stessi embrioni in un punto secondo momento (vedi risultato rappresentativo in figura 3). Nota: Modelli di colorante assorbimento varieranno a seconda del colorante usato, durata dell'esposizione e dell'età embrione. Una vasta gammadell'assorbimento colorante attraverso una singola preparazione è tipica e riflette la variazione nel grado di permeabilizzazione.
- Identificare gli embrioni vitali. Dopo posizione di embrioni permeabilizzate marcatura, proseguire con lo sviluppo dell'embrione a temperatura ambiente oa 25 ° C. Ritorno cestino o camera diapositiva per il microscopio. Osservare in fluorescenza blu canale e acquisire l'immagine di tuorlo autofluorescenza in embrioni permeabilizzate precedentemente identificati. Valutare la vitalità secondo la normale progressione di distribuzione tuorlo (vedi Rand et al. 1 e risultati rappresentativi in Figura 3). Nota: Altre caratteristiche morfologiche dell'embrione osservato con microscopia brightfield possono essere usate per valutare la vitalità. Si raccomanda di stabilire il livello di permeabilità che è compatibile con la redditività essere determinata empiricamente con ciascun colorante e lo sforzo di volare utilizzato.
- Valutare droga o tossina effetti embrioni vitali permeabilizzate.
- EMBRIONI proceduressed con il protocollo di cui sopra sono pronti per un numero di convenzionali analisi successive esposizione ai farmaci o tossine. Molti dei vari tipi di analisi sono considerati nella discussione qui sotto e comprendono l'osservazione diretta della morfogenesi in embrioni vivi, così come le analisi post-fissazione immunoistochimica. Entrambi questi approcci sono arricchiti con l'uso di coloranti vitali (ad esempio, GFP) che rivelano pattern di espressione genica e la linea cellulare e profili morfologia.
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Representative Results
Dispositivi di manipolazione degli embrioni sono raffigurati nella figura 1 per aiutare a visualizzare i dispositivi "fatti in casa" per la manipolazione nei protocolli di cui sopra. Risultati visto in Figura 2 illustrano l'effetto robusto di allevamento embrioni a 18 ° C sulla loro capacità di essere permeabilizzate da EPS in fase avanzata di sviluppo. Questa condizione è applicata nella fase protocollo 2.1. Efficacia dell'acido carbossilico colorante CY5 per rivelare i vari livelli di permeabilità tipicamente osservati in EPS embrioni trattati è visto in Figura 3. La dinamica dello sviluppo della distribuzione colorante nel tuorlo è anche visto nella figura 3, rivelando un criterio usato per valutare la vitalità , come descritto nel protocollo fase 4.2. L'utilità del colorante CY5 nel determinare embrione permeabilizzazione successivo al trattamento tossina, fissazione con formaldeide e immunocolorazione è illustrato dal risultato in Figura 4.
Dispositivi di Figura 1. Manipolazione degli embrioni per il metodo EPS. Il paniere a fondo piatto è utilizzato in dechorination e EPS fasi di esposizione (A, A '). Il cestino di sviluppo viene utilizzato per lunghi esposizioni sviluppo di embrioni permeabilizzate (B, B '). La camera di scorrimento viene utilizzato per le esposizioni di sviluppo più brevi e maggiore risoluzione delle immagini di embrioni vivi (C, C '. Vedere il testo per una descrizione più dettagliata).
Figura 2. Effetto di invecchiamento a 18 ° C su EPS efficacia in embrioni in fase avanzata. Embrioni sono stati prelevati per due ore, seguita da invecchiamento a 18 ° C per 20 ore (Pannelli AA ",
Figura 3. Costituzione di CY5 in embrioni permeabili e vitali. Embrioni sono stati prelevati a 25 ° C per 2 ore e invecchiato per 14 ore a 18 ° C (equivalente a 7-9 embrioni hr a 25 ° C, fase 12). Dopo dechorination, EPS trattamento è stato eseguito (01:40 in MBIM per 1 min) seguita da incubazione in CY5 colorante (50 pm di MBIM-T per 15 min). Gli embrioni sono stati lavati tre volte in MBIM-T e trasferiti al carrello sviluppo con MBIM nel serbatoio. Lo sviluppo è stato permesso di proceed per 8 ore a temperatura ambiente. La diffusione delle CY5 (rosso) è ripreso nel canale rosso lontano immediatamente dopo il trattamento di tintura e lavaggio (Pannello A) e dopo 8 ore di sviluppo (Panel B). La distribuzione del tuorlo è visto da autofluorescenza nel canale blu. Dye assorbimento, e quindi la permeabilità, si vede variare da embrione embrione. CY5 colorante (rosso) è visto di localizzare al tuorlo (blu), che diventa concentrato al lume intestinale nella fase 16 (viola, pannello B).
Figura 4. Determinazione di permeabilizzazione e metilmercurio effetti in embrioni fissi e immunostained. Gli embrioni sono stati raccolti a 25 ° C per 2 ore e invecchiato per 14 ore a 18 ° C (equivalente a 7-9 embrioni hr a 25 ° C, fase 12). Dopo dechorination, trattamento EPS è stato fatto (01:40 in MBIM per 1 min) seguita da incubazione inCY5 dye (50 micron in MBIM-T per 15 min) insieme a metilmercurio (50 micron MeHg, pannello B) o DMSO controllo solvente (concentrazione finale 0,1%, Panel A). Gli embrioni sono stati lavati con MBIM-T e collocati in un cesto di sviluppo con MBIM: M3 fluido nel serbatoio e affinato per 8 ore aggiuntive a temperatura ambiente. Gli embrioni sono stati poi fissati in due fasi 4% paraformaldeide-eptano preparato da un protocollo standard 14. La colorazione è stata eseguita con anti-Fasciclin II (verde in A, B e nero in A ', B') per etichettare i motoneuroni e anticorpi anti-ELAV (rossi in A, B) per etichettare tutti i corpi cellulari dei neuroni. CY5 colorante viene rivelata da fluorescenza diretta, che richiede l'esposizione prolungata a causa di intensità di fluorescenza diminuita a causa di fissazione (CY5 è pseudo-colore blu in tutti i pannelli). Gli effetti di metilmercurio sono visti nel patterning irregolare e ClusteAnello dei corpi cellulari dei neuroni cordotonali laterali (ELAV-positivi, etichettati in rosso e denotati con le frecce bianche in B contro A). Inoltre, una ramificazione caratteristica del segmentale (SN) (frecce verdi solidi A ') è visto essere altamente variabile con orientazione MeHg (frecce verdi solidi in B ") conformi agli effetti precedentemente segnalati di MeHg sull'embrione 15. Proiezione del intersegmentale e segmentaria nervi alle loro radici sono considerati essere spostato posteriormente con l'esposizione MeHg (aperto freccia verde in B '). Nota: Il metilmercurio è una potente neurotossina. Si deve prestare attenzione a indossare guanti e occhiali protettivi durante la manipolazione. Lo smaltimento deve essere fatto attraverso un impianto di sicurezza ambientale istituzionale e di servizio.
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Discussion
Il metodo di cui sopra delinea un mezzo per ottenere embrioni di Drosophila vitali che sono accessibili ai piccoli trattamenti molecola attraverso una vasta gamma di sviluppo. Questo metodo presenta il romanzo e semplice constatazione che l'invecchiamento embrioni a 18 ° C permette di permeabilizzazione di embrioni in fase avanzata con la stessa efficacia, come visto in precedenza solo negli embrioni in fase iniziale. Inoltre, l'uso del colorante CY5 acido carbossilico lontano rosso come indicatore di permeabilità è dimostrato efficace in applicazioni di post-fix e non interferisce con marcatori fluorescenti rosse e verdi convenzionali che possono essere utilizzati per rivelare fenotipi sviluppo. Questi risultati avanzano significativamente l'efficacia e l'utilità del metodo EPS.
Questo metodo è suscettibile di analisi sia di vita e di preparazioni di embrioni fissi. Utilizzando la microscopia in campo chiaro e la camera di diapositive set up, caratteristiche tipiche di segnare nel primo semestre dello sviluppo embrionale sono movimenti morfogenetici talicellularization del blastoderm, la formazione solco cefalico, l'allungamento germband e retrazione germband 1. Con reporter GFP o RFP endpoint più specifici possono essere individuate, ad esempio, i modelli di segmentazione precoce e la formazione di strutture neurali in sviluppo successivo 1. GFP e RFP report consentono anche l'osservazione di eventi di sviluppo nel vivere embrioni permeabilizzate sia nella camera di scorrimento e preparazioni cesto di sviluppo. Un metodo semplice per determinare la tossicità lordo di un farmaco o sostanza chimica applicata è di monitorare il pattern di proteine tuorlo auto-fluorescenza nel canale blu per determinare un ritardo o cessazione di sviluppo 1.
La metodologia EPS ha anche un grande potenziale per ampliare gli strumenti investigativi per insetti non-modello, in particolare, la zanzara, che condivide una simile architettura del guscio d'uovo. Applicazione di piccole molecole di embrioni di altre specie di insetti avrebbe aperto un viale di investigatidove approcci genetici standard a studi funzionali attualmente mancano. Gli embrioni sviluppati in cesti possono essere trattati per la fissazione di formaldeide, quindi aprendo analisi per la vasta gamma di reagenti di immunoistochimica disponibili per gli studi di Drosophila. Tuttavia, questo passaggio richiede una determinazione post-fix di permeabilizzazione essere fattibile per correlare fenotipi con embrioni che erano stati resi accessibili al farmaco. L'applicazione di CY5 colorante acido carbossilico è dimostrato altamente efficace per questo approccio. Acido carbossilico CY5 è efficacemente ripreso in embrioni permeabilizzate (Figura 3A). Durante lo sviluppo CY5 è concentrato nel tuorlo, che poi è sequestrato nel lume intestinale formando nella fase 14, e successivamente (Figura 3B). Dopo la fissazione, CY5 fluorescenza è marcatamente ridotta, ma attendibilmente rilevabile nell'intestino e serve come un marcatore di quegli embrioni che sono stati efficacemente permeabilizzate fin dall'inizio (vedi ris rappresentativiult Figura 4). Va notato che il rilevamento CY5 in questa fase richiede esposizioni più lunghe videocamera (ad esempio, 1-4 secondi) per il rilevamento. Pertanto, il punteggio di fenotipi con i modelli di immunoistochimica può procedere utilizzando il segnale CY5 per confermare embrioni simile permeabilizzate insieme con marcatori tessuto specifici (ad esempio, gli anticorpi specifici neurali visto in Figura 4).
La sfida più grande in questo metodo è la sensibilità della vitalità dell'embrione al processo di permeabilizzazione, qualcosa che ha a lungo tormentato tentativi prima di sviluppare questo metodo 9,10,16. Viabilità a seguito di permeabilizzazione è età-dipendente crudamente, e aumenta notevolmente il vecchio l'embrione è su di permeabilizzazione 9. Tuttavia, come si è illustrato in precedenza, permeabilità diventa sempre più difficile con età 1. Un recente rapporto ora dimostra la capacità di permeabilize embrioni fase avanzata (fase 14) da ri-invocando l'epatitetane come solvente in combinazione con d-limonene 17. L'ampia utilità di questo secondo metodo non è chiaro come solo un effetto della droga è stato caratterizzato (nocodazole) e l'applicazione di precedenti embrioni stadio non è stato descritto 17. Inoltre, l'applicazione del 18 ° C passo di sviluppo di cui sopra rese fase tardiva permeabilità e ulteriore evita l'uso di solventi organici tossici. L'investigatore che è nuovo per il protocollo EPS sperimenterà variabilità permeabilizzazione e vitalità risultati su tentativi iniziali. La procedura descritta qui danno il ricercatore gli strumenti per variare sistematicamente le condizioni di trattamenti di permeabilizzazione e le successive fasi di incubazione per ottimizzare le condizioni di specifici ceppi di Drosophila che stanno lavorando nel proprio ambiente di laboratorio.
Un'ulteriore sfida con il metodo è la variabilità assorbimento chimico visto dall'embrione embrione. Questa variabilità si riflette nella eterogeneità deiCY5 colorante assorbimento visto in embrioni immediatamente dopo il trattamento colorante (Figura 3A). Al contrario, rodamina B colorante è più rapidamente e uniformemente dispersi tutti i tessuti embrionali di CY5 colorante (Figura 2B "). Così, una certa variabilità embrione-to-embrione può essere ospitava nelle proprietà di distribuzione della sostanza chimica, farmaco o tossina di interesse ed è inerente al metodo. Dove quantificazione di dose è critico, si raccomanda che l'assorbimento del farmaco o tossina di interesse è caratterizzato attraverso un metodo analitico alternativo. Tuttavia, la facilità di protocollo di cui sopra, e la capacità di schermare centinaia di embrioni, permette al ricercatore di valutare le risposte di dose e segnare fenotipi caratteristici con poco investimento di risorse, rendendo per un potente primo approccio a farmaci o tossine caratterizzano in questo altamente sviluppata modello di sistema.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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