Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
De codering van de ervaringen in de hersenen en de consolidatie van de lange-termijn geheugen is afhankelijk van gen transcriptie. Het identificeren van de functie van specifieke genen in het coderen ervaring is een van de belangrijkste doelstellingen van de moleculaire neurowetenschappen. Bovendien is de functionele organisatie van bepaalde genen met specifieke gedragingen heeft implicaties voor het begrijpen van de basis van neuropsychiatrische aandoeningen. Inductie van robuuste transcriptie's waargenomen in de hersenen van muizen na verscheidene gedrags manipulaties. Terwijl sommige genetische elementen herhaaldelijk worden gebruikt volgende verschillende gedragsmatige manipulaties en in verschillende hersenkernen transcriptionele programma's algemeen uniek voor het inducerende prikkels en de structuur waarin ze worden bestudeerd 1,2.
In deze publicatie wordt een protocol beschreven voor robuuste en uitgebreide transcriptie profilering van hersenkernen van muizen in reactie op gedrags-manipulatie. Hetprotocol wordt aangetoond in het kader van de analyse van genexpressie dynamiek in de nucleus accumbens na acute cocaïne bieden. Na een bepaalde in vivo ervaring, het doelwit zenuwweefsel wordt ontleed; gevolgd door RNA-zuivering, reverse transcriptie en het gebruik van microfluïdische arrays voor een uitgebreide analyse van qPCR meerdere target genen. Dit protocol is gericht uitgebreide analyse (adressering 50-500 genen) beperken hoeveelheden uitgangsmateriaal, zoals kleine hersenstalen of enkele cellen.
Het protocol is het meest voordelig voor parallelle analyse van meerdere monsters (bijvoorbeeld enkele cellen, dynamische analyse na de farmaceutische, virale of gedragsproblemen verstoringen). Echter, kan het protocol ook dienen voor de karakterisering en de kwaliteitsborging van de monsters voorafgaand aan het hele genoom studies van microarrays of RNAseq, alsook de validering van gegevens die zijn verkregen uit het hele genoom studies.
Introduction
Dynamische organisatie van de hersenen in staat stelt cognitieve en gedragsmatige flexibiliteit. Ervaringen worden gecodeerd door wijzigingen in de structuur en sterkte van verbindingen tussen neuronen in de hersenen 3. Deze "ervaringsafhankelijke plasticiteit" is het resultaat van inductie van specifieke patronen van genexpressie die de benodigde eiwitten voorziet modificatie van synaptische structuur en sterkte 4. De identificatie van gen-regulatorische netwerken via de vorming van lange-termijn geheugen is een van de kernelementen van de moleculaire neurowetenschappen, met de verwachting dat de identificatie van de dominante elementen van de transcriptie-programma inzicht zal geven in de fundamentele beginselen die vorming van het geheugen, maar ook doelen voor behandeling van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Transcriptionele programma ontvouwen in temporeel gedefinieerde golven, die elk coderen voor genen van andere aard, die belangrijk zijn voor different momenten in de uitvoering van de resultaten van de signalering evenement 1,2. Het is daarom belangrijk om transcriptionele dynamiek richten op een uitgebreide tijdelijke tijdschema, teneinde de volledige complement van genen geïnduceerd identificeren en inzicht in de potentiële functie volgens de dynamiek van de inductie.
Drugsverslaving is een robuuste vorm van ervaring-afhankelijke plasticiteit veroorzaakt door de langdurige effecten van drugs op de neurale circuits in de hersenen 5,6. Eerste, acute blootstelling aan middelen kan leiden tot de ontwikkeling van verslaving en de overgang naar chronisch gebruik. Contextuele informatie is een cruciaal element in de ontwikkeling van verslaving. Drugs geassocieerd omgevingsfactoren zijn groot belang toegekend in de hoofden van drugsgebruikers. Contextuele informatie herinneren een drugsgebruiker van verleden drugservaring kan terugval naar drugs verlangen opwekken, zelfs na lange periodes van onthouding van drugs blootstelling 7,8.Vandaar de grote klinische uitdaging in verslaving – de neiging van verslaafden om nog lang recidief na ontwenningsverschijnselen zijn verdwenen 9.
Sensitisatie is een eenvoudig model van cocaïne ervaring nuttig voor de studie van de mechanismen van drugsverslaving. In deze breed bestudeerde model voor de langdurige sensibilisatie veroorzaakt door chronische blootstelling aan drugs worden knaagdieren eerst gewend aan saline injecties (intraperitoneaal, IP) in een nieuwe omgeving (open veld kamer waarin de locomotorische activiteit bewaakt) ; dan krijgen ze dagelijkse injecties van cocaïne in het open veld kamers terwijl hun activiteit bewaakt 10 (figuur 1). Deze gedrags paradigma resulteert typisch in een robuuste sensibilisatie van locomotorische gedrag (8-12 voudig boven uitgangswaarde activiteit) 11, die gedurende een periode van maanden na beëindiging van cocaïne injecties, waaruit de vorming van een pervasive geheugen sporen van drugs ervaring.
De neurale circuits van de beloning, van nature betrokken bij het versterken van het gedrag van essentieel belang voor het succes van een soort (bijvoorbeeld voeding, geslacht), wordt uitgebuit door drugs tot drugs geassocieerd gedrag 12,13 versterken. De moleculaire en cellulaire mechanismen die de ervaring van misbruik van drugs wordt versterkt lijken op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van declaratieve of semantische herinneringen in andere hersenstructuren 14 te zijn. Daarom is de robuustheid van de sensitisatie model maakt het aantrekkelijk modelsysteem mechanismen ervaring plasticiteit onderzoeken.
De nucleus accumbens (NAC) is een centrale integrator van de hersenen van de beloning circuits, en is uitgebreid in verband met de ontwikkeling van verslaving 5,6. De vorming van verslaving afhankelijk transcriptie van nieuwe eiwitten in de nucleus accumbens en robuustductie van duidelijk gestructureerde transcriptie programma's wordt waargenomen in de NAC volgende cocaïne ervaring 15-19. De acute transcriptionele respons op blootstelling aan cocaïne is waarschijnlijk om te functioneren op verschillende niveaus om aan te passen aan de sterke inductie stimulans en om de productie van nieuwe eiwitten die zijn verantwoordelijk voor de structurele en elektrofysiologische veranderingen geïnduceerd door blootstelling aan het geneesmiddel 6,19-22.
Om de studie van moleculaire mechanismen ervaring plasticiteit van de hersenen te bevorderen, wordt een protocol beschreven voor de uitgebreide analyse van transcriptie dynamica in hersenweefsel monsters na gedragsbeïnvloeding. Het protocol wordt weergegeven in de context van de gedrags ervaring bestudeerd in de Citri lab – sensitisatie, gebruik microfluïdische dynamische arrays voor transcriptionele analyse. De beschreven protocol is uiteraard niet beperkt tot het bestuderen thij nucleus accumbens in de context van sensitisatie, maar kan worden toegepast op een groot aantal gedragsparadigma's en hersengebieden. In feite kan dit protocol worden toegepast lichaamsweefsels buiten de hersenen en diverse ondergaat of manipulaties van het organisme onderzocht.
Het protocol is ruwweg verdeeld in vier stappen. In de eerste stap wordt het dier blootgesteld aan de gedrags paradigma; in de tweede stap het weefsel gemicrodissecteerde; in de derde stap – mRNA wordt gezuiverd, reverse getranscribeerd en gemerkt, en in de laatste stap de gegevens worden geanalyseerd.
In de context van transcriptionele dynamiek bestuderen, de precieze timing en definitie van de ervaring zijn waarschijnlijk de belangrijkste experimentele parameters te controleren. Daarom onze gedragsmodel keuze is die van sensitisatie, een systeem dat hoge experimentator regelaar maakt over de parameters van de experience. Bijkomende gedrags-paradigma's die precieze timing en adressen te activeren verschillende modellen van ervaring-afhankelijke plasticiteit of vorming van het geheugen beschikbaar zijn. Deze modellen zijn voorzien van angst conditionering 23, acute kooiverrijking 24,25, nieuw object exploratie 26 en visuele ervaring volgende donkere opfok 27. Toch sensitisatie is een solide en samenhangend gedrags manipulatie, waardoor een sterk doordringende geheugen trace die duurt maanden na cocaïne ervaring 28.
De hersenen is verdeeld, gevolgd door handmatige microdissectie van de nucleus accumbens. Het is onze ervaring dat handmatige microdissection van snel voorbereid hersenplakjes biedt de meest betrouwbare en snelle methode voor het extraheren van het weefsel aan de gedrags-paradigma relevant, en met ervaring, de grenzen van het weefsel zichtbaar worden en dat makkelijk te herkennen. Als alternatief zou fijne plakjes prepar zijned, gevolgd door laser-microdissectie. Hoewel deze methode maakt het mogelijk zeer gedefinieerde afbakening van de regio van belang, het is traag (en dus het risico van verlies van labiele mRNA), vervelend en vereist dure speciale apparatuur (een microscoop voorzien van een laser-capture setup). Het protocol hierin gedefinieerd kan ook worden aangepast om eencellige transcriptionele analyse handmatig aspiratie van cytoplasma visueel geïdentificeerde cellen middels patch pipetten 29. Het is belangrijk op te merken dat de beschreven protocol verschaft een populatiegemiddelde, terwijl het zeer waarschijnlijk dat in de meeste gevallen slechts een subpopulatie van de cellen in het weefsel daadwerkelijk betrokken als reactie op de ervaring. Het is van belang transcriptie profileren selectieve wijze vanuit specifieke celpopulaties reageren op de ervaring, maar bespreking van deze benaderingen is dan de huidige scope.
Voor mRNA-zuivering, reverse-transcriptie en qPCR opvragen, het weefselwordt verstoord door het door fijne naalden, gevolgd door het gebruik van in de handel verkrijgbare kits (voor meer informatie, zie Tabel 8). De keuze wordt geïnformeerd door de ervaring met deze methodieken, die betrouwbare extractie van hoge kwaliteit RNA en robuuste resultaten van downstream-toepassingen te verzekeren.
Terwijl het protocol beschreven voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays kunnen monsters worden gesondeerd genexpressie middels eindpunt PCR, low-throughput qPCR genexpressie microarrays of diepe sequencing. De voorkeur voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays komt door het feit dat mRNA verkregen hersenkernen volgende gedragsparadigma's vaak beperken hoeveelheden. Dynamische arrays bieden een platform dat efficiënte uitgebreide analyse van transcripten mogelijk maakt uit een groot aantal parallelle monsters in een enkel experiment. Na de eerste overname van de microfluïdische systeem (meestal een institutionele purchase), experimenten relatief lage bedrijfskosten. Naar aanleiding van deze analyse, kan verdere bevraging van de monsters worden uitgevoerd met behulp duurder platforms om te zoeken naar nieuwe transcripties (door microarrays of RNAseq) met de dynamische arrays bieden een uitgebreide referentie voor kwaliteitsborging. Tenslotte, voor gegevensanalyse, standaard benaderingen worden gebruikt. Specifieke aanwijzingen met betrekking tot problemen die zich kunnen voordoen zal in de tekst van het protocol worden besproken.
Dit protocol is het meest geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in een grondig onderzoek van hun systeem van belang, het bestuderen van meerdere voorwaarden en herhalingen. Het protocol is ook het meest geschikt voor onderzoekers die reeds in zijn aangescherpt (door middel van microarray of RNAseq experimenten) op een subset van 50-500 genen van belang, dat ze geïnteresseerd zijn in herhaaldelijk bevragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesvolle karakterisering van genexpressie van hersenweefsel na gedragsparadigma's hangt af van: 1) Een zorgvuldige behandeling van muizen tijdens de gedrags-paradigma; 2) Snelle en nauwkeurige dissectie van weefsel van belang; 3) RNA-veilige maatregelen om de integriteit van RNA waarborgen; en 4) zorgvuldige planning van primers en experimentele opmaak en precisie en aandacht voor detail voorbereiding van de qPCR analyse.
Het doel van de procedure is de dynamiek van transcriptionele g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
References
- Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
- Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
- Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
- Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).
- Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
- Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, S91-S117 (2000).
- Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
- Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
- Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
- Carlezon, W. A., et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
- Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
- Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
- Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
- Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
- Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
- Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
- Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
- Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
- Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
- Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
- Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).
