Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
Die Codierung von Erfahrungen im Gehirn und der Konsolidierung von Langzeiterinnerungen hängen von Gen-Transkription. Identifikation der Funktion bestimmter Gene bei der Codierung Erfahrung ist eines der Hauptziele der molekularen Neurowissenschaften. Darüber hinaus ist die funktionale Vereinigung von definierten Genen, die mit spezifischen Verhaltensweisen hat Folgen für das Verständnis der Grundlage der neuropsychiatrischen Störungen. Induktion der Transkription robust Programmen im Gehirn von Mäusen nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen beobachtet. Während einige genetische Elemente sind immer wieder nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen und in verschiedenen Hirnkerne verwendet werden, sind Transkriptionsprogramme Gesamt einzigartig für die induzierende Stimuli und der Struktur, in der sie untersucht 1,2.
In dieser Veröffentlichung wird ein Protokoll für die robuste und umfassende Transkriptionsprofilierung aus Hirnkerne von Mäusen in Reaktion auf die Verhaltensmanipulation beschrieben. DieProtokoll im Rahmen der Analyse der Genexpression Dynamik im Nucleus accumbens nach akuter Kokain Erfahrung gezeigt. Im Anschluss an eine In-vivo-Erfahrung definiert, die Ziel neuronalen Gewebe seziert; gefolgt von RNA-Reinigung, reverse Transkription und Nutzung von mikrofluidischen Arrays für umfassende qPCR Analyse von mehreren Zielgenen. Dieses Protokoll wird zur umfassenden Analyse (Adressierung 50-500 Gene) zu begrenzen Mengen des Ausgangsmaterials, wie kleine Gehirnproben oder sogar einzelne Zellen ausgerichtet.
Das Protokoll ist für die parallele Analyse von mehreren Proben (zB Einzelzellen, dynamische Analyse folgenden pharmazeutischen, virale oder Verhaltensstörungen) am vorteilhaftesten. Doch das Protokoll könnte auch für die Charakterisierung und Qualitätssicherung der Proben vor der gesamten Genoms Studien dienen durch Microarrays oder RNAseq, sowie die Validierung von Daten aus Gesamtgenom-Studien.
Introduction
Dynamische Organisation des Gehirns ermöglicht kognitive und Verhaltensflexibilität. Erfahrungen werden durch Modifikationen der Struktur und Festigkeit der Verbindungen zwischen Neuronen im Gehirn 3 kodiert. Diese "Erfahrung abhängige Plastizität" ist das Ergebnis der Induktion von spezifischen Mustern der Genexpression, die die notwendigen Proteine enthält zur Modifikation der synaptischen Struktur und Festigkeit 4. Die Identifikation von Gen-regulatorischen Netzwerke der Vermittlung der Bildung von Langzeiterinnerungen ist ein zentraler Grundsatz der molekularen Neurowissenschaften, mit der Erwartung, dass die Identifizierung der dominierenden Elemente der Transkriptionsprogramme Einblick in die Grundprinzipien der Regulierung der Gedächtnisbildung sowie Ziele für bieten Behandlung von neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Störungen. Transkriptionsprogramme entfalten in zeitlich definierten Wellen, die jeweils Gene kodieren unterschiedlichen Charakters, die für different Stufen der Umsetzung der Ergebnisse des Signalisierungsereignis 1,2. Es ist daher wichtig, Transkriptions Dynamik auf einer detaillierten Zeitskala anzugehen, um so das volle Komplement von Genen induziert identifizieren, und einen Einblick in die Potentialfunktion entsprechend der Dynamik der Induktion.
Drogenabhängigkeit ist eine robuste Form der Erfahrung abhängige Plastizität durch die lang anhaltende Wirkung von Drogen auf neuronale Schaltkreise im Gehirn verursacht 5,6. Initial, akute Exposition gegenüber Drogen, kann zur Entwicklung von Sucht und den Übergang zur chronischen Anwendung führen. Kontextinformationen ist ein wesentliches Element in der Entwicklung von Sucht. Drug-assoziierte Umweltreize sind von großer Bedeutung in den Köpfen der Drogenabhängigen zugeordnet. Kontextinformationen erinnert einen Drogenmissbrauch in der Vergangenheit Drogenerfahrung kann Rückfall in Drogenverlangen auslösen, auch nach längerer Abstinenz von Arzneimittelexposition 7,8.Daher die große Herausforderung in der klinischen Sucht – die Neigung zu Rückfällen von Süchtigen auch lange nach Entzugserscheinungen haben 9 nachgelassen.
Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein einfaches Modell von Kokain Erfahrung bei der Untersuchung von Mechanismen der Drogenabhängigkeit. In dieser weit untersuchten Modell für die langfristige Sensibilisierung durch chronische Exposition gegenüber Drogen induziert werden Nagetiere erste Kochsalzinjektionen (intraperitoneale; IP) gewöhnt in einer neuen Umgebung (einem offenen Feld Kammer, in der ihre Bewegungsaktivität wird überwacht) ; dann, tägliche Injektionen von Kokain erhalten sie in den offenen Bereich Kammern während ihrer Tätigkeit überwacht 10 (Abbildung 1). Diese Verhaltens Paradigma führt typischerweise zu einem robusten Sensibilisierung der Bewegungsverhalten (8-12 fach über Grundaktivität) 11, die für einen Zeitraum von Monaten nach Beendigung der Kokain-Injektionen erhalten bleibt, was die Bildung einer PERVasive Speicher Spur von Drogenerfahrung.
Die neuronalen Schaltkreise der Belohnung, natürlich bei der Verstärkung Verhalten wesentlich für den Erfolg einer Spezies (zB Fütterung, Geschlecht) beteiligt sind, wird von Drogenmissbrauch Drogen-assoziierten Verhaltensweisen verstärken 12,13 ausgebeutet. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Erfahrung von Drogen verbessert scheinen ähnlich zu den Mechanismen der Bildung von deklarativen oder semantische Speicher in anderen Gehirnstrukturen 14 zugrunde, sein. Daher ist die Robustheit des Verhaltenssensibilisierung Modell macht es zu einem attraktiven Modellsystem, um Mechanismen der erfahrungsabhängigen Plastizität zu studieren.
Die Nucleus accumbens (NAC) ist eine zentrale Integrator des Gehirns Lohn-Schaltung, und wurde ausgiebig mit der Entwicklung von Sucht 5,6 verbunden. Die Bildung von Sucht hängt Transkription neuer Proteine in dem Nucleus accumbens und robustProduktion von klar strukturierten Transkription Programme ist in der folgenden NAc Kokain Erfahrung 15-19 beobachtet. Die akute Reaktion auf Kokain Transkriptions Gefahr besteht, dass auf mehreren Ebenen, um der starken Induktionsreiz anzupassen und die Produktion neuer Proteine lenken Funktion, die sind für die strukturelle und elektrophysiologische Veränderungen durch die Einwirkung der Droge 6,19-22 induzierte verantwortlich.
Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen der erfahrungsabhängige Plastizität im Gehirn zu fördern, ist ein Protokoll für die umfassende Analyse der Transkription Dynamik der Hirngewebeproben folgenden Verhaltensmanipulation beschrieben. Das Protokoll wird im Rahmen des Verhaltens Erfahrung studierte in den Citri Labor veranschaulicht – Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, Verwendung mikrofluidischen dynamische Arrays für die Transkriptionsanalyse. Das beschriebene Protokoll ist selbstverständlich nicht auf das Studium t begrenzter Nucleus accumbens im Rahmen von Verhaltenssensibilisierung, könnte aber zu einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen und Hirnregionen aufgebracht werden. Tatsächlich könnte dieses Protokoll, um Körpergewebe außerhalb des Gehirns angewendet werden, und eine Vielzahl von Erfahrungen oder Manipulationen des Organismus untersucht.
Das Protokoll wird grob in vier Stufen unterteilt. Im ersten Schritt wird das Tier an den Verhaltensparadigma unterzogen; in der zweiten Stufe das Gewebe microdissected; im dritten Schritt – mRNA gereinigt, revers transkribiert und sondiert, und in einem letzten Schritt werden die Daten analysiert.
Im Rahmen der Untersuchung Transkriptionsdynamik, der genaue Zeitpunkt und die Definition der Erfahrung sind die wohl wichtigsten Versuchsparameter zu steuern. Aus diesem Grund ist, dass der Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, ein System, das hohe Niveau der Experimentator Steuerung ermöglicht über die Parameter der Erfah unsere Verhaltensmodell der Wahlce. Zusätzliche Verhaltensparadigmen, die präzises Timing aktivieren und sprechen verschiedene Modelle der erfahrungsabhängigen Plastizität oder Gedächtnisbildung zur Verfügung stehen. Diese Modelle sind mit Angst Anlage 23, akute Umweltanreicherung 24,25, Roman Objekt Exploration 26 und visuelles Erlebnis folgenden dunklen Aufzucht 27. Noch, Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein konsequent robuste Verhaltensmanipulation, die Schaffung eines hochdurchdringende Gedächtnisspur, die für Monate nach Kokain Erfahrung dauert 28.
Das Gehirn wird geschnitten, gefolgt von einer manuellen Mikrodissektion des Nucleus accumbens. Es ist unsere Erfahrung, dass die manuelle Mikrodissektion aus schnell zubereitet Hirnschnitten bietet die zuverlässige und schnelle Methode der Extraktion der relevanten Verhaltens Paradigma Gewebe und mit der Erfahrung, die Grenzen des Gewebes deutlich werden und ohne weiteres zu erkennen. Alternativ könnte feine Scheiben prepar seinED, gefolgt von Laser-Mikrodissektion. Obwohl dieses Verfahren ermöglicht hoch definierten Abgrenzung des Bereichs von Interesse, es ist langsam (also zu riskieren, die labilen mRNA), mühsam und erfordert teure Spezialausrüstung (ein Mikroskop mit einem Laser-Capture-Einrichtung vorhanden ist). Die hier definierten Protokoll könnte auch auf Einzelzelltranskriptionsanalyse durch manuelle Aspiration von Zytoplasma der Zellen visuell identifiziert mit Patch-Pipetten 29 angepasst werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das beschriebene Protokoll sieht eine Bevölkerung Durchschnitt, ist es sehr wahrscheinlich, dass in den meisten Fällen nur eine Subpopulation von Zellen innerhalb des Gewebes tatsächlich in Reaktion auf die Erfahrung beteiligt. Es ist von Interesse, um die Transkription in selektiver Weise aus bestimmten Zellpopulationen als Reaktion auf die Erfahrungen Profil, aber Diskussion dieser Ansätze ist, über den aktuellen Bereich.
Für die mRNA-Reinigung, Reverse-Transkription und qPCR Abfrage, das Gewebewird, indem es durch feine Nadeln, gefolgt von der Nutzung von kommerziell erhältlichen Kits gestört (für weitere Informationen siehe Tabelle 8). Die Wahl wird von Erfahrungen mit diesen Methoden, die zuverlässige Extraktion von hochwertigen RNA und robuste Ergebnisse von Downstream-Anwendungen zu gewährleisten informiert.
Während das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-qPCR beschriebenen Verwendung dynamische Arrays können Proben für die Genexpression mittels Endpunkt-PCR, geringe Durch qPCR, Genexpression-Microarrays oder tiefe Sequenzierung untersucht werden. Die Präferenz für die Hochdurchsatz-qPCR unter Verwendung dynamischer Anordnungen ist aufgrund der Tatsache, dass die mRNA erhalten aus Hirnkernen folgenden Verhaltensparadigmen ist oft der begrenzende Mengen. Dynamische Arrays eine Plattform, die eine effiziente umfassende Analyse der Transkripte aus einer großen Anzahl von Proben parallel in einem einzigen Experiment ermöglicht. Nach der anfänglichen Erwerb des mikrofluidischen Systems (allgemein institutioneller purchase), sind Experimente relativ preiswert zu laufen. Nach dieser Analyse könnten weitere Abfrage der Proben durchgeführt unter Verwendung teurer Plattformen, um für neue Transkripte (von Microarrays oder RNAseq) mit den dynamischen Arrays eine umfassende Referenz für die Qualitätssicherung zu suchen. Schließlich ist für die Datenanalyse, Standardansätze genutzt. Konkrete Hinweise über Probleme, die auftreten können, werden in dem Text des Protokolls erörtert.
Dieses Protokoll ist für die Ermittler interessiert in einer gründlichen Untersuchung ihres Systems von Interesse, das Studium mehrere Bedingungen und Wiederholungen am besten geeignet. Das Protokoll ist auch am besten geeignet für die Ermittler, die bereits in (durch Microarray-Experimente oder RNAseq) auf einer Teilmenge von 50-500 Gene von Interesse, die sie interessiert sind Abfragen wiederholt geschliffen haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erfolgreiche Charakterisierung der Genexpression von Hirngewebe folgenden Verhaltensparadigmen ist abhängig von: 1) Sorgfältige Behandlung von Mäusen während der Verhaltens Paradigma; 2) Schnelle und präzise Präparation von Gewebe von Interesse; 3) RNA-Safe-Maßnahmen, um die Integrität der RNA zu gewährleisten; und 4) Sorgfältige Planung von Primern und experimentelle Layout sowie Präzision und Liebe zum Detail in der Vorbereitung für die qPCR-Analyse.
Das Ziel der beschriebenen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
References
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