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Immunology and Infection

Développement d'une varicelle-zona immunité à médiation cellulaire spécifique-Virus IFN-γ ELISPOT pour évaluer la suite de cordon ombilical transplantation de sang

Published: July 09, 2014
doi:
10.3791/51643
, , , , ,
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine,Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine,Université de Montréal, 3Department of Paediatrics,Université de Montréal

Summary

Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l'interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV).

Abstract

Virus varicelle-zona (VZV) est une cause importante de morbidité et de mortalité à la suite ombilical transplantation de sang de cordon (UCBT). Pour cette raison, la prophylaxie anti-herpétique est administré systématiquement aux bénéficiaires UCBT pédiatriques pour prévenir les complications associées à l'infection VZV, mais il n'existe aucune preuve fondée sur le consensus solide, qui définit sa durée optimale. Parce T immunité à médiation cellulaire est responsable du contrôle de l'infection VZV, l'évaluation de la reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV suivante UCBT pourrait fournir des indications quant à la prophylaxie doivent être maintenues ou peuvent être interrompues. A cette fin, un interféron gamma spécifique VZV (IFN-γ) immunospot lié à une enzyme (ELISPOT) a été développée pour caractériser la production d'IFN-γ par les lymphocytes T en réponse à une stimulation in vitro avec le vaccin contre VZV vivant atténué irradié. Ce test fournit une mesure rapide, reproductible et sensible du VZV c spécifiqueell immunité approprié pour la surveillance de la reconstitution de l'immunité spécifique VZV dans un environnement clinique et d'évaluation de la réponse immunitaire aux antigènes de VZV médiation.

Introduction

Tout d'abord effectuée en 1989, UCBT est de plus en plus utilisé dans le cadre du traitement de différentes maladies du sang néoplasiques et non néoplasiques chez les enfants de 1. Le VZV est un alphaherpèsvirus humaine cytopathique qui provoque deux maladies différentes, la varicelle (après l'infection primaire) et l'herpès zoster (après réactivation). Après l'infection primaire, le VZV persiste tout au long de la vie de l'hôte à l'abri dans les nerfs sensoriels de ganglions rachidiens. Une des complications infectieuses les plus menaçants suivants UCBT est associé à VZV 2-4. Dans notre centre clinique, en l'absence de prophylaxie VZV, l'incidence cumulative de la maladie VZV maladie de VZV à 3 ans était de 46% postUCBT 2. Chez ces patients, l'infection de novo avec ou réactivation du VZV est souvent associée à la diffusion viscérale pour le système nerveux central, les poumons et le foie 5-7. En prophylaxie résultat, l'acyclovir, le valacyclovir ou le famciclovir est couramment administré à UBBénéficiaires CT 8,9. Cependant, cette stratégie de traitement ne prend pas en compte le potentiel de protection de lymphocytes T spécifiques de VZV ou la cinétique de reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV. Problèmes potentiels liés à l'utilisation croissante de la prophylaxie anti-herpétiques à long terme comprennent a) surtraitement patient; b) le développement de la résistance aux antiviraux 10,11; et c) la dégradation du VZV reconstitution immunitaire spécifique 12,13. Parce que la détection des lymphocytes T spécifiques fonctionnels VZV est en corrélation avec la présence d'une protection à long terme de l'infection VZV et l'amélioration de l'issue clinique 4,14,15, le suivi des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre le VZV pendant la période post-transplantation pourrait aboutir à une utilisation plus rationnelle des médicaments antiviraux traitement en permettant aux médecins de distinguer les patients qui pourraient bénéficier de la prophylaxie VZV de celles dont le système immunitaire est capable de contrôler la réplication du VZV 4,13.

Le test ELISPOT IFN-γ est largement utilisé pour les réponses immunitaires médiées par des cellules de contrôle dans une variété de systèmes expérimentaux et les conditions cliniques. Taches sont générées suivant le clivage d'un substrat chromogène, la génération d'un précipité visible et stable au niveau du site de la réaction. Chaque spot individu représente ainsi l'empreinte d'une cellule de cytokine production individuelle. IFN-γ ELISpot non seulement mesure la capacité des cellules individuelles ex vivo pour produire de l'IFN-γ en réponse à une stimulation in vitro avec l'antigène apparenté, mais il fournit également une estimation de la fréquence de la réponse des cellules dans une population cellulaire donnée 16,17. En plus de sa grande sensibilité, l'IFN-γ ELISpot est simple à effectuer, ce qui rend son utilisation possible dans le cadre de protocoles cliniques personnalisés destinés à guider l'initiation ou l'arrêt du traitement antiviral. La procédure décrite ci-dessous décrivantes un test ELISpot qui est spécifiquement conçu pour détecter et mesurer la production d'IFN-γ par les cellules mononucléaires du sang périphérique après stimulation in vitro avec des antigènes dérivés du VZV.

Protocol

Ce protocole de recherche a été approuvé par le Conseil du CHU Sainte-Justine, Montréal, Québec, Canada, où l'étude a été menée institutionnelle d'évaluation éthique. Le consentement éclairé a été demandé et obtenu de tous les participants à l'étude, leurs parents ou tuteurs légaux. Toutes les procédures effectuées aux jours 1 et 2 doivent être effectuées dans des conditions stériles (c'est à dire sous une hotte à flux laminaire). Les procédures de sécurité standard…

Representative Results

Le protocole ELISPOT IFN-γ détaillé ci-dessus a été développé et optimisé dans notre laboratoire pour mesurer l'ampleur et la qualité des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VZV 4. Diverses sources d'antigène VZV peuvent être utilisés pour l'étape de stimulation. Il s'agit notamment: a) disponible dans le commerce détergents extraits inactivés du VZV infectés cellules Vero 18; b) les piscines de chevauchement des peptides synthétiques…

Discussion

Modifications et dépannage: essais IFN-γ ELISpot ont été utilisées pour examiner les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre une variété de pathogènes microbiens, y compris le type de virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) 24,25, virus de l'hépatite C (VHC) 26, 27, et Mycobacterium tuberculosis 28,29, pour n'en nommer que quelques-uns. Ici, nous avons décrit le développement d'un test ELISPOT IFN-γ pour mesurer l'im…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les participants de l'étude et de leurs parents. Nous tenons également à remercier le Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montréal, Canada) pour l'accès à son lecteur ELISpot, le Dr Lubo Alexandrov pour l'analyse statistique, et Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois et Martine Caty pour expert technique assistance. Pris en charge par des subventions du Fonds d'opération le Pour Les Projets de recherche clinique et D'évalutation des technologies (CHU Sainte-Justine) à HS et PO, par la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, et par la Leukemia & Lymphoma Society de Canada. ISF a été soutenu par des bourses de la Fondation CHU Sainte-Justine et le Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG a été le récipiendaire de bourses du Département de microbiologie, infectiologie et d'immunologie de l'Université de Montréal (Bourse Gabriel-Marquis), FRQS, et les Instituts de la santé Recherche du Canada (IRSC). NM a été soutenu par la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondation Cole, et FRQS.

Materials

Leucocep tube VWR 89048-936/89048-932 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. 
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Protect from light.
Benzonase nuclease Novagen 70746-3 Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate Millipore MSIPS4W10 Sterile with pore size of 0.45 µm. 
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody BD Biosciences 551221 NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide Technologies PM-VZV-IE63 Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody BD Biosciences 554550 4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase  Bio-Rad Life Science 170-3554 Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science 170-6432 Protect from light.
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Salem Fourati, I., Grenier, A., Jolette, É., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-γ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10.3791/51643 (2014).
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