臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Summary

単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。

Abstract

水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）は、臍帯血移植（UCBT）以下の罹患率および死亡率の重要な原因である。このため、抗ヘルペス予防は、VZV感染に伴う合併症を防ぐために、小児UCBT受信者に体系的に投与されたが、その最適な期間を定義強い、エビデンスに基づくコンセンサスが存在していません。 T細胞媒介性免疫は、UCBTの予防を維持すべきかまたは中止することができるかどうかの指示を提供することができ、以下のVZV特異的T細胞応答の再構成を評価し、VZV感染の制御に関与するからである。そのためには、VZV特定γインターフェロン（IFN-γ）酵素結合免疫（エリスポット）アッセイは、照射された弱毒生VZVワクチンを用いたin vitro刺激に応答してTリンパ球によるIFN-γ産生を特徴づけるために開発されました。このアッセイは、VZV固有のCの、迅速な再現性かつ高感度な測定を提供エル臨床現場でのVZV特異的免疫の再構成を監視し、VZV抗原に対する免疫応答性を評価するのに適した免疫を媒介した。

Introduction

1989年に初めて行われ、UCBTは、ますます子供¹における種々の新生物および非腫瘍性血液疾患の治療の一部として使用される。 VZVは（再活性化後）2異なる疾患、（一次感染後）水痘や帯状疱疹を引き起こす細胞変性人間アルファヘルペスウイルスである。一次感染後、VZVは後根神経節の感覚神経内守らホストの寿命を通じて持続します。 UCBT次の最も脅かす感染性合併症の一つは、VZV ^2-4に関連している。当社の臨床センターでは、VZV予防がない場合には、VZV病のVZV疾患の累積発生率は3年でpostUCBTは46％であった^。これらの患者において、 デノボでの感染又はVZVの再活性化は、多くの場合、中枢神経系、肺及び肝臓^5-7に内臓の普及に関連している。その結果、アシクロビル、バラシクロビル、またはファムシクロビル予防は、一般的にUBに投与されているCTの受信者^8,9。しかしながら、この治療戦略が考慮VZV特異的Tリンパ球またはVZV特異的T細胞応答の再構成の速度論の保護電位をとらない。長期的な抗ヘルペス予防の拡大使用に伴う潜在的な問題）は、患者過剰治療が含まれ; b）は、抗ウイルス薬剤耐性^10,11の開発、およびC）VZV特異的免疫再構築^12,13の減損。機能のVZV特異的なTリンパ球の検出は、VZV感染と臨床転帰の改善^4,14,15からの長期的な保護の存在と相関するので、移植後の期間の間に、VZVに対して向け細胞性免疫応答を監視するウイルスのより合理的な使用をもたらすかもしれませんVZVの恩恵を受ける患者を区別するために医師を可能にすることによる治療は、免疫システムのVZV複製^4,13を制御することができるものと予防。

IFN-γELISpotアッセイが広く、実験系および種々の臨床症状のモニタリング細胞媒介性免疫応答のために使用される。スポットは、反応部位に表示され、安定した沈殿物を生成し、発色基質の切断後に生成される。個々のスポットは、それによって個々のサイトカイン産生細胞のフットプリントを表しています。 IFN-γELISpotは、同族抗原とin vitroでの刺激に応答してIFN-γを産生する個々の細胞をex vivoでの能力を測定するだけでなく、所与の細胞集団^16,17における細胞応答の頻度の推定値を提供する。その高い感度に加えて、IFN-γELISPOTは、抗ウイルス治療の開始や停止を誘導することを目的とし、個人の臨床プロトコルの文脈で可能なのを利用して、実行するのは簡単である。 describ下に詳述した手順エス具体VZV由来抗原によるインビトロ刺激後の末梢血単核細胞によるIFN-γの産生を検出し、測定するように設計されELISpotアッセイ。

Protocol

この研究計画は、研究を行ったCHUサントジュスティーヌ、モントリオール、ケベック、カナダの機関倫理審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントを求め、すべての研究参加者、両親または法的保護者から得られた。すべての手順は、1日目に行い、2（層流フードの下で、すなわち ）、無菌条件下で行わなければならない。ヒトの血液を処理するための標準的な安全?…

Representative Results

上記に詳述IFN-γエリスポットプロトコルは大きさおよびVZV 4に対して向け細胞媒介性免疫応答の質を測定するために開発され、我々の研究室で最適化した。 VZV抗原の多様なソースは、刺激工程のために使用することができる。これらは、a）VZVから市販されている洗剤の不活化抽出物は、Vero細胞を18感染 ; IE63 15とORF4 19を含む特定のVZVコードされたタンパク質?…

Discussion

修正およびトラブルシューティング：IFN-γエリスポットアッセイは、ヒト免疫不全ウイルス1型^{（HIV-1）24,25、C}型肝炎ウイルス^（HCV）26を含む微生物病原体の種々に対して向けられた細胞性免疫応答を調べるために使用されてきた^{、 27、}および結核菌 ^28,29は 、ほんの数名に。ここでは、小児UCBT受信者の回復にVZV特異的免疫再構築の相関を定義する希望を?…

Materials

Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.