アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

トリパノソーマは 、牛^1、ヒトアフリカトリパノソーマ症（HAT）、または睡眠病、及び消耗性疾患、ナガナを引き起こすキネト寄生虫である。哺乳類宿主の血流中及びツェツェバエベクトルとの間の寄生を交互に。多くの細胞小器官の組成物は、これらの異なる細胞外の条件^2-5に応答して変化する。

Glycosomesは解糖に関与する酵素の多くは区画化された専門性の高いペルオキシソームです。発達と環境に調節された様式^4-11グライコ組成が変化。現在、グライコダイナミクスを研究するために使用される最も一般的な技術は、電子と蛍光顕微鏡であり;高価な、時間と労働集約的な技術、簡単にハイスループット分析に適合していない。

これらの制限を克服するために、蛍光グライコレポーター系黄色蛍光タンパク質（のeYFP）を増強する、glycosomes ¹²融合タンパク質を導く配列（PTS2）を標的ペルオキシソーム、に融合される確立されている。 PTS2eYFP融合タンパク質のインポート時に、glycosomes蛍光になる。細胞小器官分解し、フローサイトメトリーによって測定することができる蛍光の損失リサイクル結果。細胞（5,000細胞/秒）の多数は、そのような固定化および実装などの大規模なサンプル調製なしにリアルタイムで分析することができる。この方法は、環境条件の変動に応答して細胞小器官組成の変化を検出する迅速な方法を提供する。

Introduction

トリパノソーマはアフリカのヒトにおける睡眠病および消耗性疾患、ナガナ、牛が発生します。これらの疾患の治療に用いられる薬剤は、ワクチンが利用可能でない、時代遅れと非常に毒性であり、薬剤耐性の発生の可能性は、新しい薬物標的¹の検索を必要とする。

そのライフサイクル、Tの間トリパノソーマ、昆虫ベクターおよび哺乳動物宿主間で交互;寄生虫が生き残るなければならない非常に異なる環境を提示する二つのホスト。寄生虫は、異なる環境条件に暴露されるように、代謝的および形態学的変化の数が発生する。最も劇的な変化のいくつかは、単一膜結合寄生虫特定のマイクロボディで観察glycosomes ^13と呼ばれる。

血糖値が比較的高い（〜5 mM）の血流中の血流寄生虫は（BSF）は、解糖WHから独占的にATPを生成するニトリルミトコンドリアの代謝は¹⁴抑制される。解糖が細胞質で起こる他の真核生物、T.とは異なりトリパノソーマは glycosomes ^14,15における糖分解酵素の大部分を区分する。寄生虫は吸血中にツェツェバエによって取り込まれ、ハエによって摂取され、15分以内に検出不能なレベルまで低下するグルコースの低下を経験している。昆虫、procyclicフォーム（PCF）、寄生虫の代謝は、より柔軟かつグルコース、ならびにプロリンなどのアミノ酸、ATP ^16-18の合成に使用することができる。比較プロテオミクス研究は、ライフサイクルglycosomalにおける依存性の変化と血流寄生虫で増加し、解糖タンパク質とミトコンドリアタンパク質およびTCA回路と呼吸鎖^13,19に関与ミトコンドリアタンパク質を明らかにした。多くの研究は、BSFとPCF glycosomesとの違いに焦点を当てているが、少しはENVに応答して発生PCF glycosomesの変化についてはほとんど知られていないironmental変化。

ハエの後腸では、血糖値は、摂食²⁰時の過渡的な増加に低い。 インビトロ研究において最もにおいて、PCF寄生虫は、グルコースを含む培地で増殖させる。しかし、最近の研究は、グルコース可用性¹⁷に応答して有意にそのPCF代謝の変化を示した。ブドウ糖、プロリン取り込み及びプロリン脱水素酵素活性の増加¹⁸が存在しない場合には。ミトコンドリア代謝のこの変化は、おそらくグライコ組成および形態の変化を伴うが、これは直接的に評価されていない。

電子および蛍光顕微鏡は、T.でグライコダイナミクスを研究するために使用される一般的な技術であるトリパノソーマ ^2,21-24。これらのプロトコルは、リアルタイムの研究およびハイスループットプロトコルに適応する時間および労働集約的、高価、困難である。この制限は、蛍光オルガネラレポーター系のuを克服するために哺乳動物および酵母系において細胞小器官を研究するためのsed、Tで使用するために変更されましたトリパノソーマ ^12。

蛍光オルガネラレポーター系は、広くそのような酵母、植物、および哺乳動物細胞などの高等真核生物^25-27において使用されている。このようなシステムでは、蛍光タンパク質は、特異的細胞小器官へのタンパク質を標的とするアミノ酸配列に融合される。標的タンパク質の分解又は合成が蛍光により測定され、オルガネラ組成の変化は、細胞の蛍光の変化によって反映される。

強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のオープンリーディングフレームは、タイプIIペルオキシソーム標的配列^（PTS2）12に融合されると、PTS2eYFPタンパク質は成熟した、インポートコンピglycosomes及び蛍光にインポートされ、フローサイトメトリーによってモニターすることができる。グライコ物の変動は、細胞蛍光の変化によって反映される。このシステムは、レゾールのを助けることができるグライコ組成物における環境的に誘導された変化を制御する仕組みをヴィング。

この原稿は、ライブ寄生虫リアルタイムのグライコ動態を監視するためにフローサイトメトリーと組み合わせてPCF寄生虫でグライコレポーター系の生成を記載し、それは異なる環境に応じて、グライコ組成の変化に追従するために使用されている方法の例を提供する。新鮮な培地グライコ組成の変化をトリガに要約すると、グライコ組成物は、細胞外グルコース濃度との対数期培養物の通過によって影響される。このシステムは、トリパノソーマ類および他の寄生虫に他の細胞小器官の動的挙動を研究するために修飾することができる。

Protocol

1。一般トリパノソーマ畜産 SDM79メディア製剤（ 表1）の固形分を秤量する。 50円錐mlまたはジップロック袋に入れて、4℃で保存する。 NOTE：試薬は、少なくとも6ヶ月間安定である。 37℃の水浴中でウシ胎児血清（FBS）を解凍し、逆さにして、定期的に混ぜる。注：FBSを滅菌溶液として供給者から受信される。 FBSを滅菌フィルターは、寄生虫の増殖を支持す…

Representative Results

このシステムでは、グライコ組成物中のグルコース依存性の変化が観察された。細胞を、グルコース含有培地中で増殖させる場合、2つの集団が観察される; 1明るく1薄暗い（ 図2A）。薄暗い細胞は明るい細胞が成熟および未熟glycosomes 12の混合物を抱くながらPTS2eYFPをインポートしていない未熟glycosomesを抱く。グルコースが培地中に存在する場合、グライコタンパク質の誤…

Discussion

Glycosomesが不可欠、ダイナミック、寄生虫固有の細胞小器官である。これらのオルガネラの生合成、維持、増殖およびリモデリングを制御するプロセスは、おそらく、治療目的のために悪用される可能性が薬物標的を含む。そのような薬物標的の可能性の高い存在にもかかわらず、グライコバイオジェネシスの分野は、主に、急速な、動的な、細胞小器官の応答を監視することで扱いやすい?…

Materials

Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium Chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation