형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei는 가축 일에, 인간의 아프리카 트리파노소마 증 (HAT) 또는 수면 질병 및 소모성 질환, nagana 원인 kinetoplastid 기생충이다. 포유류의 호스트의 혈류와 체체 파리 벡터 사이의 기생충 번갈아. 많은 세포 소기관의 구성은 서로 다른 세포 외 조건 2-5에 대한 응답으로 변경됩니다.
Glycosomes은 작용에 관여하는 효소의 많은 실형되는 고도로 전문화 페 록시이다. 개발과 환경 규제 방식 4-11 Glycosome 구성이 변경됩니다. 현재 glycosome 역학을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 전자와 형광 현미경 아르; 비싸고, 시간과 노동 집약적 및 고 처리량 분석에 쉽게 적응하지 않은 방법.
이러한 제한, 형광등 glycosome 기자 시스템을 극복하기 위해12 glycosomes하는 융합 단백질을 지시하는 퍼 옥시 대상 시퀀스 (PTS2)에 융합되는 노란색 형광 단백질 (EYFP)를 강화하는 설립되었습니다. PTS2eYFP 융합 단백질의 수입시에, glycosomes 형광된다. 소기관 저하 및 유동 세포 계측법에 의해 측정 될 수있는 형광 손실 재활용 결과. 셀은 다수의 (5000 세포 / 초)와 같은 고정 및 장착으로 광범위한 샘플 준비없이 실시간으로 분석 할 수있다. 이 방법은 환경 조건의 변동에 응답하여 소기관 조성의 변화를 검출 신속한 방법을 제공한다.
Introduction
Trypanosoma brucei 소 아프리카 인간 수면병 및 소모성 질환, nagana을 발생합니다. 이들 질환의 치료에 사용되는 약물은 백신을 사용할 수없는, 낡은 매우 독성이며, 약제 내성의 개발을위한 잠재적 인 신규 한 약물 표적에 대한 검색을 필요로한다.
수명주기, T. 중 brucei, 곤충 벡터와 포유류의 호스트 번갈아; 기생충이 생존해야하는 매우 다른 환경을 제시 두 호스트. 기생충이 상이한 환경 조건에 노출되는 형태로 대사 및 변경이 발생할 수. 가장 극적인 변화 중 일부는 단일 막 경계 기생충 특정 microbodies에서 관찰되고, glycosomes 13 불린다.
포도당 수준이 상대적으로 높은 아르 (~ 5 mM)을 혈류와 혈류 기생충 (BSF)의 작용도 ë 통해 독점적으로 ATP를 생성ILE 미토콘드리아 대사는 14을 억압한다. 다른 진핵 달리하는 작용은 세포질에서 발생 T. brucei는 glycosomes (14, 15)에서 당분 해 효소의 대부분을 compartmentalizes. 기생충은 bloodmeal 동안 체체 파리에 의해 촬영 및 즉석 섭취되는 15 분 이내에 발견 할 수없는 수준으로 떨어지는 혈당 강하를 경험하게된다. 곤충들의 대사, procyclic 형태 (PCF)는 기생충보다 유연하고 글루코스뿐만 아니라, 프롤린 등의 아미노산, ATP 16-18의 합성에 사용될 수있다. 비교 단백체 연구는 라이프 사이클 glycosomal에 따라 변화와 혈류 기생충 증가 당분 단백질과 미토콘드리아 단백질과 TCA 사이클과 호흡 체인 13, 19에 관여하는 미토콘드리아 단백질을 알 수있다. 많은 연구가 BSF와 PCF glycosomes의 차이점에 초점을 맞추고있는 반면, 거의 ENV에 대한 응답으로 발생하는 PCF의 glycosomes의 변화에 대해 알려진ironmental 변경됩니다.
파리의 hindgut에서 포도당 수준은 수유 20시 일시적인 증가로 낮다. 시험 관내 (in vitro) 연구에서 대부분으로, PCF 기생충은 포도당을 포함하는 배지에서 재배되고 있습니다. 그러나, 최근의 연구는 크게 님의 PCF 대사 변경 가용성 17 포도당 것을 증명하고있다. 글루코오스, 프롤린 흡수 및 프롤린 탈수소 효소 활성의 증가 (18)의 부재. 미토콘드리아 대사의 변화가 예상 glycosome 조성물 및 형태의 변화를 수반하지만, 이것은 직접 평가되지 않았다.
전자 및 형광 현미경은 일반적인 기술은 T.에 glycosome 역학을 연구하는 데 사용됩니다 brucei 2,21-24. 이러한 프로토콜은 시간 및 비용이 많이, 실시간 연구 및 높은 처리량 프로토콜에 적응하기 어려운 노동이다. , 소기관 형광 리포터 시스템을 U 이러한 한계를 극복하기 위해포유류와 효모 시스템의 세포 기관을 공부 나오지는 T.에 사용하기 위해 수정되었습니다 brucei 12.
형광등 – 세포 소기관 기자 시스템은 광범위하게 효모, 식물 및 동물 세포 25 ~ 27로 높은 진핵 생물에서 사용되어왔다. 이러한 시스템에서, 형광 단백질은 특정 세포 내 소기관으로 단백질을 표적 아미노산 서열에 융합된다. 대상 단백질의 분해 나 합성은 형광을 통해 측정되고, 세포 기관의 구성의 변화는 세포의 형광의 변화에 의해 반영됩니다.
강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP)의 오픈 리딩 프레임 타입 II 페 록시 타겟팅 시퀀스 (PTS2) 12에 융합 될 때, PTS2eYFP 단백질 성숙, 수입 능력 glycosomes 형광으로 가져가 유동 세포 계측법을 통해 모니터링 할 수 있습니다. glycosome 조성의 변화는 세포의 형광의 변화에 의해 반영됩니다. 이 시스템은 레졸에 도움이 될 수 있습니다glycosome 조성물 중의 환경 변화에 의한 규제 메커니즘 ving.
이 원고 생방송 기생충 실시간 glycosome 역학을 모니터링하는 유동 세포 계측법과 관련 PCF 기생충에 glycosome 리포터 시스템의 생성을 설명하고, 그것이 다른 환경에 응답 glycosome 조성의 변화를 수행하기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 신선한 미디어 glycosome 구성의 변화를 트리거로 요약하면, glycosome 조성물은 세포의 포도당 농도와 로그 상 문화의 통과에 의해 영향을 받는다. 이 시스템은 트리 파노 솜 및 기타 기생충의 다른 세포 소기관의 동적 거동을 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycosomes은 필수, 동적, 기생충 특정 세포 기관이다. 이러한 세포 소기관의 생합성, 유지 보수, 증식과 리모델링을 조절하는 과정은 가능성이 치료 목적으로 악용 될 수 약물 표적을 포함한다. 이러한 약물 표적의 가능성이 높은 풍부 불구 glycosome 생합성의 필드는 주로 급격한 동적, 소기관 반응을 모니터링하는 다루기 쉬운, 높은 스루풋 시스템의 부족으로, 다른 유기체와 유사한 프로세스를 연구 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
