En ny Afklaring metode til at synliggøre biliær Degeneration Under Lever Metamorphosis i havlampret ( Petromyzon marinus)
Summary
Havlampret miste galdeblære og galdeveje under metamorfose, en proces der ligner humant galdeatresi. En ny fiksering og afklaring metode (klarhed) blev modificeret til at visualisere hele galdetræet hjælp af laser konfokal mikroskopi. Denne metode giver et kraftfuldt værktøj til at studere galde degeneration.
Abstract
Galdeatresi er en sjælden sygdom i vorden, med en anslået 1 i 15.000 frekvens i det sydøstlige USA, men mere almindelig i østasiatiske lande, med en rapporteret frekvens på 1 i 5000 i Taiwan. Selvom meget er kendt om forvaltningen af galdeatresi, dens patogenese er stadig undvigende. Den havlampret (Petromyzon marinus) giver en enestående mulighed for at undersøge mekanismen og progression af galde degeneration. Havlampret udvikle sig gennem tre forskellige livsstadier: larve, parasitter og voksne. Under overgangen fra larver til parasitisk juvenile, havlampret undergå metamorfose med dramatisk reorganisering og ombygning i ekstern morfologi og indre organer. I leveren er hele galdeveje tabt, herunder galdeblære og galdetræet. En nyudviklet metode kaldet "klarhed" blev ændret for at tydeliggøre hele leveren og krydset med tarmen i metamorfe havlampret. Denproces biliær degeneration blev visualiseret og skelnes under havlampret metamorfose ved hjælp af laserscanning konfokal mikroskopi. Denne metode giver et kraftfuldt værktøj til at studere galdeatresi i en unik dyremodel.
Introduction
Havlampret udvikle sig gennem tre forskellige livsstadier 1,2. Larve havlampret (L) tilbringer mest tid i jordhuler som bundlevende filtratorer. Efter at have gået gennem syv metamorfe stadier af dramatiske ændringer i ydre morfologi og reorganisering i indre organer 3, de resulterende unge (JV) indtaste en parasitisk stadium, hvor de lever af blod og vævsvæsker fra host fisk, øge kropsmasse mere end 100 gange . Efter 1,0-1,5 years fodring på værten fisk i havet eller store søer, voksne ophøre fodring i det tidlige forår og migrere ud i floder for at gyde og derefter dø 1,2.
Under metamorfose, det havlampret leveren mister galdeblære og hele galdetræet, en evolutionær mutantfænotypen der efterligner den menneskelige spædbarn sygdom galdeatresi. Infant galdeatresi er en sjælden pædiatrisk leversygdom med svære medicinske komplikationer 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenese og ætiologien af galdeatresi er stort set ukendte 4. Patienter med galdeatresi dø inden for to år efter fødslen, medmindre kirurgisk indgreb (Kasai procedure) udføres 5. Efterfølgende disse patienter kræver omfattende kliniske ledelse og ofte levertransplantation 6. Mange teorier galdeatresi ætiopatogenese er blevet foreslået, såsom virusinfektion, medfødte misdannelser, autoimmune sygdomme og toksisk spot. Men bidraget fra hver til udviklingen af galdeatresi stadig usikkert 7,8,9,10.
I modsætning til spædbørn, der lider patologisk galdeatresi undergår havlampret udviklingsmæssigt programmeret galdeatresi uden omfattende necroinflammation, fibrose eller cirrose 10. Dyrene kan lide forbigående cholestase under denne proces 10, men tilpasse sig denne udviklingsmæssige tilstandvia de novo-syntese og sekretion af galdesalte i tarmen efter udviklingsmæssige galdeatresi, udover kendte mekanismer, såsom reduktion af galdesalt syntese i leveren 11. Denne udviklingsproces i havlampret giver den eneste kendte mulighed for at undersøge udviklingen af galdeatresi.
En nyudviklet metode kaldet "klarhed" giver høj opløsning billeddannelse i komplekse pattedyr nervesystemer ved at omdanne intakt væv ind i en optisk transparent nanoporøse hydrogel 12. Brug havlampret lever og en modificeret CLARITY-protokollen, kan intakt væv billeddannelse af galde degeneration dokumenteres gennem leveren metamorfose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er modificeret ud fra en ny metode kaldet "klarhed" 12, som tværbinder intakt væv med polyacrylamid til dannelse af en nanoporøse hydrogel og derefter strimler væk plasmamembranen af vævet for at opnå optisk transparens og makromolekylære permeabilitet. "Klarhed" giver intakt væv billeddannelse af langtrækkende projektion og lokale kredsløb ledninger i nervesystemet. Denne nye metode kan anvendes til at visualisere hele galdevejen hos havlampret leveren under metam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender det bidrag Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi takker også Dr. Melinda Frame ved Center for Advanced Microscopy ved Michigan State University for hendes tekniske support i laserscanning konfokal mikroskopi. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra De Store Søers Fiskerikommission til YWCD og WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
