הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)
Summary
צמד ים הים לאבד את כיס מרה ודרכי מרה במטמורפוזה, תהליך דומה לatresia מרה האנושי. קיבעון חדש ושיטת הבהרה (CLARITY) שונה כדי להמחיש את עץ המרה כולו באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור ניוון מרה.
Abstract
atresia מרה הוא מחלה נדירה של ינקות, עם 1 ב15,000 תדירות מוערכת בארצות הברית דרום מזרח, אך נפוצה יותר במדינות מזרח אסיה, עם תדירות מדווחת של 1 ב5,000 בטייוואן. למרות שהרבה ידוע על ניהול atresia מרה, פתוגנזה שלה היא עדיין חמקמקה. צמד ים הים (מרינוס Petromyzon) מספק הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנון והתקדמות של ניוון מרה. צמד ים הים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים: זחל, טפיל, ומבוגרים. במהלך המעבר מזחלים לנוער טפיל, צמד ים הים עובר מטמורפוזה עם ארגון מחדש דרמטי ושיפוץ במורפולוגיה חיצונית ואיברים פנימיים. בכבד, מערכת המרה כולו הולכת לאיבוד, ובם כיס המרה ועץ המרה. שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" שונה כדי להבהיר את כל הכבד והצומת עם המעי בצמד ים ים מותמרים.התהליך של ניוון מרה היה דמיינו ולהבחין במטמורפוזה צמד ים ים באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור atresia מרה במודל של בעלי חיים ייחודיים.
Introduction
צמד ים ים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים 1,2. צמד ים הזחל ים (L) מבלה את רוב הזמן במחילות כמו מתקני האכלת מסנן של קרקעית ים. לאחר שעובר שבעה שלבים מותמרים של שינויים דרמטיים במורפולוגיה וארגון מחדש באיברים פנימיים 3 חיצוניים, וכתוצאה מכך בני הנוער (JV) להיכנס לשלב טפיל שבמהלכו הם ניזונים דם ונוזלי רקמה מדג מארח, להגדיל את מסת הגוף יותר מ 100 פעמים . לאחר 1.0-1.5 שנות האכלה על דגי המארח בים או אגמים גדולים, מבוגרים להפסיק האכלה בתחילת האביב ונודדים לתוך נהרות כדי להשריץ ואז למות 1,2.
במהלך המטמורפוזה, כבד צמד ים הים מאבד את כיס מרה ועץ המרה כולו, פנוטיפ מוטנטי אבולוציוני המחקה את atresia המרה מחלת תינוק האנושי. atresia מרה תינוקות הוא מחלת כבד נדירה בילדים עם סיבוכים רפואיים קשים 4,5,6,7, 8,9,10, לעומת זאת פתוגנזה ואטיולוגיה של atresia המרה אינן ידועות ברוב 4. חולים עם אטרזיה המרה למות בתוך שנתיים לאחר לידה, אלא אם כן התערבות כירורגית (הליך קסאי) מתבצעת 5. כתוצאה מכך, חולים אלה מחייבים ניהול נרחב קליני ולעתים קרובות השתלה כבד 6. תאוריות של etiopathogenesis atresia מרה רבות הוצעו, כגון זיהום ויראלי, מומים מולדים, מחלות אוטואימוניות, ועלבון רעיל. עם זאת, תרומתו של כל לפיתוחה של atresia המרה נשארת חד משמעית 7,8,9,10.
בניגוד לתינוקות שסובלים atresia המרה פתולוגי, צמד ים הים לעבור בחינה התפתחותית מתוכנת atresia מרה ללא necroinflammation נרחב, סיסטיק או שחמת 10. בעלי החיים עלולים לסבול cholestasis חולפת במהלך תהליך זה 10, אבל להסתגל למצב ההתפתחותי הזהבאמצעות דה נובו סינתזה והפרשה של מלחי מרה במעי לאחר atresia מרה התפתחותי, בנוסף למנגנונים ידועים כגון הפחתה של סינתזת מלח מרה בכבד 11. תהליך התפתחותי זה בצמד ים ים מספק את ההזדמנות היחידה הידועה כדי לבחון את ההתקדמות של atresia מרה.
שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה במערכות עצבים של יונקים מורכבים על ידי הפיכת רקמות שלמות להידרוג'ל nanoporous השקוף אופטי 12. שימוש בכבד צמד ים ים ופרוטוקול CLARITY שונה, הדמיה בשלמות רקמות של ניוון מרה יכולה להיות מתועדת לאורך המטמורפוזה כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא שונה משיטה חדשה הנקראת "בהירות" 12, שCrosslinks רקמות שלמות עם polyacrylamide כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous, ולאחר מכן רצועות מן קרום הפלזמה של הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטית וחדירות macromolecular. "בהירות" מאפשרת הדמיה בשלמות רקמות של השלכה ארוך טווח וחיווט …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתרומה של מפרץ המונד ביולוגי תחנה, אגמי מרכז מדע גדול, גיאולוגי אמריקאי. אנו מודים גם למסגרת ד"ר מלינדה במרכז למיקרוסקופי מתקדם באוניברסיטת מדינת מישיגן לתמיכה הטכנית שלה במיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת דיג האגמים הגדולים לYWCD ו-WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
