Een nieuwe Verduidelijking methode om Visualiseer Biliary Degeneratie Tijdens Lever Metamorfose in Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)
Summary
Zeeprik verliest de galblaas en galwegen tijdens metamorfose, een proces vergelijkbaar met de menselijke galgangatresie. Een nieuwe bevestiging en verduidelijking methode (duidelijkheid) werd gewijzigd om de gehele galwegen met behulp van laser scanning confocale microscopie visualiseren. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om de gal degeneratie studeren.
Abstract
Galgangatresie is een zeldzame ziekte van de kindertijd, met een geschatte 1 in 15.000 frequentie in het zuidoosten Verenigde Staten, maar vaker in Oost-Aziatische landen, met een gerapporteerde frequentie van 1 in 5000 in Taiwan. Hoewel veel bekend is over het beheer van galgangatresie, de pathogenese is nog steeds ongrijpbaar. De zeeprik (Petromyzon marinus) biedt een unieke gelegenheid om het mechanisme en de progressie van de galwegen degeneratie te onderzoeken. Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensfasen: larvale, parasitaire, en volwassen. Tijdens de overgang van larven tot parasitaire jeugdcriminaliteit, zeeprik ondergaan metamorfose met dramatische reorganisatie en verbouwing van de externe morfologie en interne organen. In de lever wordt het gehele galwegen verloren, zoals de galblaas en galwegen. Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" is gewijzigd om de hele lever en de kruising met de darm in metamorfe Zeeprik verduidelijken. Deproces van gal degeneratie werd gevisualiseerd en onderscheiden tijdens zeeprik metamorfose met behulp van laser scanning confocale microscopie. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om galgangatresie studeren in een uniek diermodel.
Introduction
Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensstadia 1,2. Larvale zeeprik (L) brengen de meeste tijd in holen als benthische filter feeders. Na het doorlopen zeven metamorfe stadia dramatische veranderingen in de externe morfologie en reorganisatie in inwendige organen 3, de resulterende jongeren (JV) Voer een parasitaire fase waarin zij zich voeden met bloed en weefsel vloeistoffen uit gastheervis en maakt de lichaamsmassa meer dan 100 keer . Na 1,0 tot 1,5 jaar voeden met de gastheer vis in de oceaan of de grote meren, volwassenen ophouden borstvoeding tijdens het vroege voorjaar en migreren in rivieren om te paaien en dan sterven 1,2.
Tijdens de metamorfose, de zeeprik lever verliest de galblaas en de hele galwegen, een evolutionaire mutante fenotype dat de menselijke zuigeling ziekte galgangatresie nabootst. Zuigeling galgangatresie is een zeldzame pediatrische leverziekte met ernstige medische complicaties 4,5,6,7, 8,9,10, maar de pathogenese en etiologie van galgangatresie zijn grotendeels onbekend 4. Patiënten met galgangatresie sterven binnen twee jaar na de geboorte, tenzij chirurgische ingreep (Kasai procedure) wordt uitgevoerd 5. Vervolgens deze patiënten vereisen uitgebreide klinische behandeling en vaak levertransplantatie 6. Veel theorieën van biliaire atresie etiopathogenese voorgesteld, zoals virale infecties, aangeboren afwijking, auto-immuunziekten en toxische insult. Echter, de bijdrage van elk tot de ontwikkeling van galgangatresie blijft onduidelijk 7,8,9,10.
In tegenstelling tot de zuigelingen die pathologische galgangatresie lijden, ondergaan zeeprik ontwikkelingsgebied geprogrammeerd galgangatresie zonder uitgebreide necroinflammation, fibrose of cirrose 10. De dieren kunnen voorbijgaande cholestase lijden tijdens dit proces 10, maar aan te passen aan deze ontwikkelingsstoornis aandoeningvia de synthese en uitscheiding van galzouten in de darm na ontwikkeling biliaire atresie, naast de bekende mechanismen zoals een vermindering van galzout synthese in lever 11. Dit ontwikkelingsproces in Zeeprik biedt de enige bekende mogelijkheid om de progressie van biliaire atresie onderzoeken.
Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" maakt hoge-resolutie beeldvorming in complexe zoogdieren zenuwstelsel door het transformeren intact weefsel in een optisch transparant nanoporeus hydrogel 12. Met behulp van de zeeprik lever en een gemodificeerd DUIDELIJKHEID protocol, kan intact weefsel beeldvorming van de galwegen degeneratie worden gedocumenteerd in de lever metamorfose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een modificatie van een nieuwe methode genaamd "duidelijkheid" 12, die intact weefsel verknoopt polyacrylamide met een nanoporeuze hydrogel, en ontdoet het plasmamembraan van het weefsel optische transparantie en macromoleculaire permeabiliteit bereiken. "Duidelijkheid" kunt intact weefsel beeldvorming van lange afstand projectie en lokale bedrading in het zenuwstelsel. Deze nieuwe methode kan worden gebruikt om de gehele galwegen visualiseren Zeeprik lever tijdens metamorf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de bijdrage van Hammond Bay Biologisch Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. We danken ook Dr Melinda Frame bij het Center for Advanced Microscopy aan de Michigan State University voor haar technische ondersteuning bij confocale laser scanning microscopie. Dit onderzoek wordt ondersteund door subsidies van de Grote Meren Visserijcommissie om YWCD en WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
