En ny Förtydligande metod för att visualisera gallan Degeneration Under Lever Metamorphosis i Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)
Summary
Havsnejonöga förlorar gallblåsa och gallgångar under metamorfos, en process som liknar mänsklig gallgångsatresi. En ny fixering och förtydligande metod (CLARITY) modifierades för att visualisera hela gallan trädet med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallan degeneration.
Abstract
Gallgångsatresi är en ovanlig sjukdom i barndomen, med en beräknad 1 i 15.000 frekvens i sydöstra USA, men vanligare i östasiatiska länder, med en rapporterad frekvens av 1 i 5000 i Taiwan. Även om mycket är känt om hanteringen av gallgångsatresi, är dess patogenes fortfarande svårfångad. Den havsnejonöga (Petromyzon marinus) ger en unik möjlighet att undersöka mekanismen och utvecklingen av galla degeneration. Havsnejonöga utvecklas genom tre olika livsstadier: larver, parasitiska, och vuxna. Under övergången från larver till parasit juvenil, havsnejonöga genomgår metamorfos med dramatiska omorganisation och ombyggnad i yttre morfologi och inre organ. I levern är hela gallsystemet förlorad, inklusive gallblåsan och den biliära trädet. En nyutvecklad metod som kallas "CLARITY" har ändrats för att klargöra hela levern och korsningen med tarmen i metamorfa havsnejonöga. Denprocess galla degeneration visualiserades och urskiljas under havsnejonöga metamorfos genom laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallgångsatresi i en unik djurmodell.
Introduction
Havsnejonöga utvecklas genom tre olika levnadsstadier 1,2. Larv havsnejonöga (L) tillbringar mest tid i hålor som bentiska filtrerare. Efter att ha gått igenom sju metamorfa stadier av dramatiska förändringar i yttre morfologi och omorganisation i inre organ 3, de resulterande ungdomar (JV) anger en parasit stadium där de livnär sig på blod och vävnadsvätska från värdfisk, öka kroppsmassan mer än 100 gånger . Efter 1,0-1,5 år livnär sig på värdfisk i havet eller stora sjöar, vuxna upphöra utfodring under den tidiga våren och vandrar in i floder för att leka och sedan dö 1,2.
Under metamorfos, förlorar havsnejonöga levern gallblåsan och hela gallan trädet, en evolutionär mutantfenotypen som efterliknar människo spädbarn sjukdomen gallgångsatresi. Infant gallgångsatresi är en sällsynt pediatrisk leversjukdom med allvarliga medicinska komplikationer 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen och etiologi av gallgångsatresi är till stor del okänt 4. Patienter med gallgångsatresi dör inom två år efter födseln, om inte kirurgiskt ingrepp (Kasai förfarande) utförs 5. Därefter dessa patienter kräver omfattande klinisk ledning och ofta levertransplantation 6. Många teorier om gallgångsatresi etiopatogenesen har föreslagits, såsom virusinfektion, medfödd missbildning, autoimmun sjukdom, och toxiska insult. Emellertid förblir inconclusive 7,8,9,10 bidraget från varje till utvecklingen av biliär atresi.
Till skillnad från barn som lider patologisk gallgångsatresi, genomgår havsnejonöga utvecklingsmässigt programmerad gallgångsatresi utan omfattande necroinflammation, fibros eller cirros 10. Djuren kan drabbas av övergående kolestas under denna process 10, men anpassa sig till denna utvecklings tillståndvia de novo-syntes och utsöndring av gallsalter i tarmen efter utvecklings gallgångsatresi, förutom kända mekanismer såsom minskning av gallsalt syntesen i levern 11. Denna utvecklingsprocess i havsnejonöga ger den enda kända möjlighet att undersöka utvecklingen av gallgångsatresi.
En nyutvecklad metod som kallas "CLARITY" möjliggör högupplöst avbildning i komplexa däggdjurs nervsystem genom att förvandla intakt vävnad i ett optiskt transparent nanoporösa hydrogel 12. Använda havsnejonöga lever och en modifierad CLARITY-protokoll, kan intakt-vävnad avbildning av galla degeneration dokumenteras genom lever metamorfos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är modifierad från en ny metod kallad "skärpa" 12, som tvärbinder intakt vävnad med polyakrylamid för att bilda en nanoporös hydrogel, och därefter skalar bort plasmamembranet av vävnaden för att uppnå optisk transparens och makromolekylär permeabilitet. "CLARITY" låter intakta-vävnad avbildning av långväga projektion och lokala krets ledningar i nervsystemet. Denna nya metod kan användas för att visualisera hela gallvägar i havsnejonöga lever under meta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner bidrag Hammond Bay biologiska station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi tackar också Dr Melinda Frame vid Centrum för avancerad mikroskopi vid Michigan State University för sin tekniska support i laserskanning konfokalmikroskopi. Denna studie har finansierats med bidrag från de stora sjöarna fiskerikommissionen till YWCD och WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
