Protocol
Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUCs) no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiração de medula óssea (BM) As células do Fêmur
- Anestesiar o rato que passará por aspiração da medula óssea do fêmur com isoflurano (1-4%) administrado com um vaporizador de precisão. Profundidade da anestesia deve ser monitorada a cada 5-10 min durante todo o procedimento por meio da observação de que não há nenhuma alteração na taxa respiratória associada à manipulação cirúrgica e / ou ouvido, do dedo do pé, e a cauda de aperto. A anestesia é induzida com isoflurano e também mantida durante todo o procedimento com isoflurano. Uma dose pré-processual de preferência de buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg por via subcutânea a cada 6-12 horas pode ser usado para prevenir a dor associada com o processo como um adjUNCT ao carprofeno.
- Aplicar pomada oftálmica para os olhos do rato após a indução da anestesia para evitar o ressecamento da córnea.
- A pele é cuidadosamente cortado a partir de uma área de pele de cerca de 150% maior do que a área do local da aspiração pretendido. Pele frouxa é removido com uma gaze úmida. Por favor, mantenha o mouse sobre uma almofada de água quente circulando ou outra superfície segura termóstato para evitar hipotermia durante o procedimento.
- Desinfetar toda a perna contendo o fêmur, que passará por aspiração com três conjuntos de scrubs alternada (alternando com qualquer um iodopovidona (Betadine) ou um de clorexidina (Nolvasan) esfoliação e 70% de álcool isopropílico ou 70% de etanol embebido esponjas de gaze).
- Umedeça um 0,5 ml de tuberculina Seringa (volume: 0,5 cc; bitola: 27,5 g) com tampão fosfato estéril (PBS), antes de aspirar o BM. Encha a seringa com 200-500 mL de PBS e expulsar imediatamente o PBS. Repita este procedimento 2-3 times.
- Manter a tíbia dobrada do fémur, empurrando a tíbia ou com o dedo ou do quinto dedo. Confirme se um plano anestésico adequado foi atingido. A seringa é realizada utilizando o polegar e o dedo indicador. Isto permite que os côndilos a ser expostos e facilita a inserção da agulha.
- Depois de molhar a seringa inserir a agulha através do tendão patelar, de modo que a agulha é apresentada de forma segura entre os dois côndilos do fémur. Mantendo a diáfise próxima da epífise do fémur com o polegar eo dedo indicador, a agulha é inserida no eixo do fémur facilmente.
- Rodar a agulha para fora e para cima, de modo que é paralelo com o eixo do fémur. Esta acção facilita a recuperação do conteúdo de medula óssea a partir do eixo do fémur.
- Gire o agulha e anti-horário, enquanto empurrando-o lentamente na cavidade da medula do fêmur. Confirme o correto posicionamento da agulha movendo suavemente a syRinge lateralmente.
- Com cuidado, puxe o êmbolo agulha para trás, criando uma pressão negativa, enquanto movendo a agulha para trás e para a frente dentro da cavidade BM. Nota: O volume da BM aspirado será de aproximadamente 5 mL, que corresponde tipicamente a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. Aspiração bem sucedida será confirmado visualmente pelo aparecimento de sangue no topo da agulha na base da seringa. Se o sangue não é visto na seringa, é provável que um fragmento de osso ou tecido pequena está preso no interior da agulha. Este pode ser retirado a partir da agulha, movendo o êmbolo para cima e para baixo em PBS (este é uma razão para que a seringa deve ser previamente cheio com PBS antes de aspirar a BM). Se o tecido não pode ser desalojado da seringa, usar uma nova agulha e seringa (de novo molhar a seringa com 200-500 ul de PBS).
- Uma vez BM é aspirado com sucesso a partir do fêmur, retire a agulha e seringa do fêmur e mouse.
- Mover aspirado BM para um pr microtuboefilled com 500 ul de PBS. Para a maioria das aplicações, as células BM deve, então, ser mantido no gelo até o processamento, se possível.
- Após a conclusão do procedimento, administrar analgésico com carprofeno 5 mg / kg por via subcutânea. Em seguida, retire do mouse da anestesia e coloque em uma almofada aquecida até que esteja totalmente recuperado. NOTA: Não deve haver nenhuma complicação ou angústia experimentada após o procedimento de aspiração, se feito corretamente.
- Antes de devolver os ratos para a área de habitação, garantir que eles são capazes de atingir e deambular comida e água. Observe os ratos para detectar sinais de perigo ou procedimento pós infecção no próximo 24 horas. Os sinais incluem: sangramento constante, anemia, letargia. Se algum destes sinais são vistos após o procedimento, o animal (s) devem ser sacrificados. Nota: BM aspiração / amostragem pode ser repetida, mas o procedimento de repetição devem ser realizadas sobre o fémur oposta para prevenir o trauma repetido da mesma perna. Há pouca informação disponível sobre o frequency essa aspiração BM pode ser realizada. Aspiração da medula óssea do fêmur é geralmente repetida não mais frequentemente do que a cada 2 semanas.
2. Avaliação do conteúdo celular em Aspirado BM Células
- Células de pellets obtidos a partir BM aspiração e coloque em um tubo de microcentrífuga por centrifugação a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou RT.
- Aspirar o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender o sedimento em 500 ul de sangue vermelho ACK tampão de lise celular (tamp de lise "de amónio-cloreto de potássio").
- Incubar as células em tampão de lise de glóbulos vermelhos, durante 10 min e em seguida adicionar 1 ml de PBS e girar novamente a mistura a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou TA. Nota: Os sedimentos de lise de glóbulos vermelhos é agora constituído por células mononucleares do BM. Estes podem ser ressuspendidos em coloração de FACS, a contagem das células, o transplante, a análise de citospina e / ou qualquer outra utilização (tal como células de MO colhidas a partir de ratinhos sacrificados seria utilizado).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femoral BM aspiração de um rato C57/B6 vivo foi utilizado para obter as células mononucleares, seguido de colheita de BM BM convencional do mesmo rato, após sacrifício. Células mononucleares BM obtidos pelos dois métodos foram então analisadas por (1) análise citológica de células BM, (2) determinar a freqüência relativa das células-tronco / progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), e (3) ex vivo cultura de HSPCs ordenados. No último ensaio, Sca1 linhagem negativa + c-kit + células (LSK) foram classificadas a partir de células mononucleares obtidos pela BM aspiração, bem como a partir de colheita de BM convencional. 150 células LSK obtidos por cada um dos métodos foram, em seguida, colocadas em placas em meio semi-sólido contendo metilcelulose citocinas mielóides-eritróide, durante 7 dias em duplicado técnica. Os dados mostrados na Figura 1, A, B, ilustra que os tipos e proporções semelhantes de células a granel e HSPCs foram vistos por morfológica e análise citométrica de fluxo utilizando um aspiração BM femoral ou colheita de BM convencional.
De modo a determinar quantitativamente a percentagem de LSK e células progenitoras mielóides visto com colheita convencional de medula óssea contra a aspiração de medula óssea femural, comparou-se a percentagem de LSK e MP subpopulações como uma frequência de células vivas totais em três aspirações independentes e colheitas de medula convencionais. Esses dados, exibida na Figura 1C, revela uma diminuição no LSK e MP subpopulações de medula óssea coletados por aspiração femoral em comparação com a colheita de medula convencional (embora esta diferença não foi estatisticamente significativa para qualquer população).
Triagem de células LSK seguido por ex vivo em cultura de metil-celulose resultou em semelhantes números de colónias e tipos de células obtidas por aspiração da medula óssea do fémur e colheita de BM convencional (como mostrado na Figura 1D). Os tipos de colónias observadas e enumeradas incluem CFU-GEMM (granulócitos, eritrócitos, monócitos, megakaryocyte unidade formadora de colônia), CFU-GM (os granulócitos, monócitos unidades formadoras de colônia) e BFU-E (eritróide-burst formando unidade).
Figura 1. Medula óssea do fêmur (BM) aspiração em ratos vivos para facilitar o exame do conteúdo da medula, sem sacrifício de camundongos. (A) Wright Giemsa cytospins de células mononucleares obtidas através BM aspiração de ratos vivos manchada. Cerca de 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares pode ser obtido em cada aspiração femoral indivíduo. Mostrado aqui são tipicamente medula conteúdo do tipo selvagem de 6 semanas de idade camundongos C57/B6 obtidos por aspiração BM femoral (direita) versus o isolamento de células BM convencional através do sacrifício de camundongos (à esquerda) (barra de escala representa 10 mm). (B) Femoral BM aspiração fornece um número adequado de células para avaliarmento do compartimento tronco / progenitoras hematopoéticas, como ilustrado aqui (à direita: as células de BM aspirado; Esquerda: células obtidas por colheita de medula de camundongos sacrificado). + Células de linhagem negativa Sca-1 + c-kit (LSK) contendo as células estaminais hematopoiéticas, bem como da linhagem negativa Sca-1-c-kit + progenitores mielóides e seus subtipos, tal como definido pela expressão de CD34 e de expressão FcγR foram analisados (porta-mãe é viva , células de linhagem-negativas). As percentagens indicadas referem-se a percentagem de células dentro do portão. (C) Quantificação da LSK (células progenitoras mielóides (MP) células, progenitores mielóides comuns (linhagem negativa Sca-1-c-KIT + CD34 + FcγR intermediário +), células progenitoras de granulócitos-macrófagos células progenitoras de megacariócitos-eritróide (linhagem negativa Sca-1-c-kit + CD34-FcγR-), tal como uma frequência de células vivas a partir de colheita de medula convencional (n (linhagem negativa Sca-1-c-kit + CD34 + FcγR +), e As barras de erro = 3) e aspiração de medula óssea femoral (n = 3). representam padrão denuação. (D) fotografias representativas de ensaio colônia metilcelulose resulta de uma semana após o chapeamento de 150 células em LSK mielóide / eritróide contendo metilcelulose (acima) e números e tipos de colônias observadas utilizando células LSK de cada método. Os tipos de colônias observadas e enumerados incluem CFU-GEMM (os granulócitos, eritrócitos, monócitos, megakaryocyte unidade formadora de colônia), CFU-GM (os granulócitos, monócitos unidades formadoras de colônia) e BFU-E (eritróide unidade formadoras de ruptura). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serial aspiração BM é um procedimento de rotina fundamental para investigação clínica de distúrbios hematológicos em seres humanos. A capacidade de executar uma série de amostragem análoga do BM em ratos para a caracterização da composição celular e componentes da BM em todo longas experiências é também muito valioso. Este processo é útil para a caracterização de HSPC de sem sacrificar o rato, mas também para detectar a presença de tipos de células adicionais na BM nos casos em que o conteúdo do sangue periférico não pode ser o reflexo de células que residem na BM. Serial aspiração BM foi utilizado de forma muito eficaz para esta finalidade mais tarde na monitorização da presença de células humanos xenoenxertados em ratinhos imunocomprometidos, por exemplo, 3. Dado que a 0,4-0,8 x 10 6 células são tipicamente recuperados com cada aspiração BM, estas células podem ser utilizadas para uma série de fins, incluindo a análise citológica (Figura 1A), diâmetrognóstico citometria de fluxo (Figura 1B), o fluxo de citometria de separação de células seguido de posterior utilização a jusante de células classificadas, incluindo cultura de células (Figura 1C), extração de ácidos nucleicos, a extração de proteínas para ensaios voltados para a caracterização proteômica do número de células limitadas, e ainda mais o transplante extraída de células. Ao mesmo tempo, é importante notar que o número de HSCs recuperados em cada aspiração femoral é limitada pelo número total de células recuperadas neste procedimento. Por exemplo, considerando a definição de HSCs como + + CD150 + CD48-CD244 células-SCA1 linhagem negativa c-kit, a freqüência de HSCs é de aproximadamente 10 HSCs/100, 000 células 7. Com base nessa frequência, cerca de 40-80 HSCs está prevista para ser recuperada com cada procedimento de aspiração. Além disso, como observado na Figura 1C, a freqüência de LSK e células progenitoras é menor, embora não atingindo significância estatística, em marro ossow células obtidas via aspiração da medula óssea femoral comparado com a colheita de medula óssea convencional. Acreditamos que essa diminuição relativa no LSK e frequência progenitor visto com aspiração em relação à colheita de medula óssea cirúrgica está relacionada com a contaminação com sangue periférico que ocorre com aspiração da medula óssea do fêmur. Estas limitações da aspiração da medula óssea do fêmur na avaliação de populações de células raras na medula devem ser observados. Uma nota adicional é que temos realizado normalmente este procedimento em ratos de 6 semanas de idade ou mais. Acreditamos que este procedimento seria cada vez mais tecnicamente desafiador com camundongos com menos de 6 semanas de idade.
Esta técnica também está bem adaptado para avaliar o quimerismo da BM ao contrário do sangue periférico, no contexto de um ensaio competitivo reconstituição contínua. Nestes ensaios, o potencial funcional do HSC de a partir de um conjunto experimental de camundongos é testado contra um conjunto conhecido número de HSC &# 8217; s com a leitura sendo quimerismo sangue periférico, bem como quimerismo do HSC do (ver revisão por Purton et al 8.). Quimerismo do sangue periférico pode contrastar do quimerismo na BM se perturbações que afetam o resultado do compartimento de células-tronco hematopoéticas na diferenciação prejudicada de HSPC de em células sanguíneas maduras que circulam. Dado que a hematopoiese definitiva não foi estabelecida até pelo menos 16 semanas após o transplante 9 e que quimerismo pode mudar depois ainda mais longos períodos de tempo 10, técnicas que facilitam o acesso mais cedo ao compartimento HSPC, como ilustrado aqui pode ser particularmente útil. Em um exemplo recente, o transplante de células competitivo BM de camundongos com deleção pós-natal homozigoto de Dnmt3a por Challen et al. Revelou reduzido quimerismo de camundongos Dnmt3a nulos no sangue periférico, mas um aumento paradoxal em HSC quimerismo de Dnmt3aNulo HSC está no BM 11. Este resultado era indicativo de um defeito de diferenciação Dnmt3a - / - HSC da apesar de um aumento na auto-renovação. Além disso, este resultado foi observado somente no sacrifício cronometrado de receptores ratos transplantados em experimentos de transplante competitivos série em intervalos de cada 16 semanas. Portanto, os ensaios que permitem a recolha de amostras de células de MO, em paralelo com o sangue periférico, sem exigir o sacrifício dos ratinhos e permitindo a observação contínua de ratinhos são bastante úteis.
Como mencionado anteriormente, a técnica aqui demonstrada é semelhante à técnica utilizada para injecção intrafemoral directamente para o espaço de cavidade de medula de ratos 2,3. Injeção direta intrafemoral provou ser muito útil para facilitar os estudos de xenoenxerto humanos em ratos onde foi mostrado para fornecer melhor enxerto em comparação directa com injeção intravenosa 6,12,13. Esta técnica tem ainda permitemed para a identificação de classe anteriormente desconhecida de povoar rapidamente HSCs humanos.
Actualmente não se sabe se a amostragem repetida da BM em ratinhos através da mesma fémur influencia a composição celular do BM ou o número de células da medula obtidas com aspirações repetidas. Além disso, a quantidade mínima de tempo conveniente para realizar os procedimentos de aspiração de repetição do mesmo fémur não é conhecido. Ao realizar as aspirações da medula óssea do fêmur repetidas no mesmo mouse, alternar o fêmur usado para BM aspiração e executar aspirados BM série em intervalos de> 2 semanas. Outros esforços focada na compreensão dos potenciais efeitos, se houver, de procedimentos de fêmur BM aspiração de série em camundongos em intervalos específicos sobre os tipos e número de células recuperadas da BM ou arquitetura da BM são necessários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
