Analys av epitelskada Producerad av<em> Entamoeba histolytica</em> Infektion

Summary

Mänsklig infektion med Entamoeba histolytica leder till amoebiasis, en viktig orsak till diarré i tropiska länder. Infektion initieras av patogen interaktioner med intestinala epitelceller, provocera öppnandet av cell-cellkontakter och därmed diarré, ibland följt av leverinfektion. Den här artikeln innehåller en modell för att bedöma de tidiga värd-patogen interaktioner för att förbättra vår förståelse av amoebiasis patogenes.

Abstract

Entamoeba histolytica är vilka smittämnen av humant amoebiasis, en viktig orsak till diarré och lever abscess i tropiska länder. Infektion initieras genom interaktion av patogenen med tarmepitelceller. Denna interaktion leder till störningar av intercellulära strukturer som tight junctions (TJ). TJ säkra tätning av epitelskiktet att skilja värdvävnad från tarmlumen. Nya studier visar att störning av TJ från parasitprotein EhCPADH112 är en förutsättning för E. histolytica invasion som åtföljs av epitelbarriär dysfunktion. Således, analys av molekylära mekanismer som är involverade i TJ demontering under E. histolytica invasion är av största vikt för att förbättra vår förståelse av amoebiasis patogenes. I denna artikel presenteras en enkel modell som gör det möjligt att bedöma inledande värd-patogen interaktioner och parasiten invasionen potential. Parametrar som skall analyseras innefattar transepithelial elektriskt motstånd, interaktion av EhCPADH112 med epitel ytreceptorer, förändringar i uttryck och lokalisering av epiteliala junctionala markörer och lokalisering av parasit molekyler i epitelceller.

Introduction

Entamoeba histolytica är en enda cell protozo ansvarig för mänsklig amoebiasis, en tarminfektion som orsakar inflammation och diarré. E. histolytica infekterar upp till 50 miljoner människor varje år, men endast omkring 10% av smittade människor utvecklar symptom i samband med amoebiasis ^1. Infektion sker vid intag av förorenad mat eller vatten som innehåller E. histolytica cystor. I tarmen, cystor producerar levande trofozoiter som följer kolon mucin och föröka ^2. Trofozoiter bildar vanligtvis cystor som utsöndras via avföringen. I andra fall, och för ännu okänd anledning, trofozoiter bryter tarmens epitel lagret och invadera underliggande vävnader. I värsta fall, de går in i blodomloppet och påverkar andra organ såsom lever ^3.

Breaking epitelbarriären kräver avbrott i epithelial transmembran strukturer som upprätthåller celler förenade. Epithelial cellkontakter är bildade genom den apikala Junktional komplex bestående av tät (TJ) och adherensgränssnitten korsningar (AJ), och desmosomer ^4. De mest apikala korsningar är TJ, och därför är de den första barriären förolämpad av E. histolytica och några andra patogener under värd invasion. TJ består av transmembran adhesionsreceptorer såsom claudins, occludin och Junktional adhesionsmolekyler (JAM) som bedriver homo-eller heterofila interaktioner med receptorer i granncellen. De är intracellulärt bundna av ställnings molekyler av zonula occludens (ZO) familj som ansluter adhesionsreceptorer till aktin cytoskelettet att ge ytterligare mekanisk hållfasthet till epitelet. TJ är ansvariga för att täta tarmvävnad från tarmlumen, förhindra alltför vatten och lösta ämnen läckage. Således, efter TJ störs av parasiten, är vävnaderna invaderade. E. histolytica utsöndrar flera molekyler såsom: (i) de som är involverade i vidhäftning av amöbor till Target celler ^5; (II), membranaktiva faktorer som deltar i avlivning av värdceller genom exocytos, exempelvis jon-kanalbildande peptider benämnda amoebapores ^6,7; och (iii) proteinaser som bryter ned extracellulära matrisproteiner, och medierar vävnadssönderfalls ^5,8,9.

Den cysteinproteas EhCP112 och adhesionsmolekylen EhADH112 som tillsammans bildar EhCPADH112 komplexet är två E. histolytica virulens proteiner som spelar en viktig roll vid demonteringen av TJ ^10. Live trofozoiter, deras totala lysat och utsöndrade produkter inducerar molekylära förändringar i TJ komplex och funktionell störning av epiteliala barriären. I denna studie visas det att EhCP112 och EhADH112 samverka med occludin och claudin-1-proteiner som leder till internalisering och nedbrytning av cellproteiner, vilket underlättar E. histolytica ingång genom paracellulära vägen.

Våra data och de som of andra grupper ^11-17 tyder starkt nödvändigheten av specifika värd-patogen interaktioner som tillåter parasit invasion. Reda ut den molekylära grunden för dessa interaktioner är av största betydelse för en bättre förståelse av amoebiasis patogenes. Selektiv störning av TJ av trofozoiter, kännetecknade av ökad paracellulär permeabilitet, kan mätas genom en minskning i transepitelial elektrisk resistans (TER). Den överföring av parasitproteiner mot värd epitel kan bestämmas genom immunofluorescens färgning och konfokal laser mikroskopi, en metod som också kan avslöja co-lokalisering av amöba virulensfaktorer med epithelial junctionala markörer som anger eventuella direkta interaktioner. I den här artikeln beskriver vi i detalj hur epitelceller och trofozoiter odlas, skördas och manipuleras för att undersöka värd-patogen interaktioner och deras konsekvenser.

Protocol

1. Upprättande och underhåll av E. histolytica Kulturer Väx axeniskt (helt fri från alla andra kontaminerande organismer) 1 x 10 5 trofozoiter av Entamoeba histolytica stam HML: IMSS klona en 18 i 16 x 125 mm odlingsrör med Teflon liner skruvlock (eller 1 x 10 6 trofozoiter i en engångs T- 25 kolv) och 15 ml (eller 50 ml i T-25-kolv) av TYI-S-33-medium (TYI-buljong kompletterad med 3% Diamond vitaminblandning, 10% värmeinaktiverat serum från vuxna nö…

Representative Results

För en lyckad E. histolytica kultur, måste två viktiga villkor uppfyllas: tillväxt i axeniska förhållanden och skörd i logaritmisk fas. Tidigare, kulturer av E. histolytica var lätt etablerade i samband med vissa arter av bakterier eller trypanosomatids 22. Men numera är det vanligt att ha axenisk odling av denna parasit betyder obestämd subkulturer av amöbor i en miljö fri från metaboliserande bakterier, svampar, protozoer, eller flercelliga celler. Dessutom är avgörande skö…

Discussion

För att studera in vitro värd-patogen interaktioner under epitel infektion av E. histolytica, är det viktigt att arbeta med väletablerade kulturer av både epitelceller och trophozoites. Till exempel, tidigare, E. histolytica kulturer hade vanligtvis upprättats i samband med vissa arter av bakterier eller trypanosomatids ^22,23. Emellertid samodling av E. histolytica kulturer är kontraproduktivt för studier av värd-patogen interaktioner eftersom observerade effektern…

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine  0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
				Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
				Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
				Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/mL
				Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ mL
				Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
				Cell culture plates, 6 Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
				25cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution