In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton
Summary
Combinatorie 5 proteine fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.
Abstract
Abbiamo sviluppato e convalidato un marchio metodologia per il monitoraggio clonale di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) con alta risoluzione spaziale e temporale per studiare in vivo ematopoiesi con il trapianto di midollo osseo modello sperimentale murino fluorescente. Marcatura utilizzando vettori lentivirali codificanti per proteine fluorescenti (PQ) combinatoria genetica ha permesso la mappatura destino cellulare attraverso avanzate di imaging microscopia. Vettori codificano cinque diversi PQ: Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, e mCherry sono stati usati per trasdurre HSPCs contemporaneamente, creando una tavolozza variegata di cellule di colore marcato. Imaging utilizzando confocale / microscopia a due fotoni ibrido consente la valutazione simultanea alta risoluzione delle cellule marcate in modo univoco e la loro progenie in combinazione con componenti strutturali dei tessuti. Volumetrica analisi su grandi aree rivelano che le cellule HSPC-derivate spettralmente codificati possono essere rilevati in modo non invasivo in vari tessuti intatti, tra cui il midollo osseo (BM), Per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto. Studi in diretta conciliano multiphoton di video-rate e confocale time-lapse imaging in 4D dimostrano la possibilità di tracciamento cellulare e clonale dinamica in maniera quantitativa.
Introduction
La produzione di cellule del sangue, ematopoiesi definito, è gestito da una piccola popolazione di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs). Queste cellule risiedono nel midollo osseo (BM) in una nicchia microambientali complesso costituito da osteoblasti, cellule stromali, tessuto adiposo, e le strutture vascolari, tutti implicati nel controllo di auto-rinnovamento e differenziazione 1,2. Come intatto BM è tradizionalmente inaccessibile alle osservazioni dirette, le interazioni tra HSPC e il loro microambiente rimane in gran parte indefinita in vivo. In precedenza, abbiamo stabilito una metodologia per visualizzare l'architettura 3D della BM intatta utilizzando confocale a fluorescenza e riflessione microscopia a 3. Abbiamo caratterizzato l'espansione di EGFP-marcati HSPCs nel BM, ma l'uso di una sola FP escludessimo analisi di rigenerazione a livello clonale. Molto di recente abbiamo approfittato della lentivirali Gene Ontology (Lego) i vettori che esprimono costitutivamente flproteine uorescenti (FPS) per contrassegnare in modo efficiente le cellule 4,5. Co-trasduzione del HSPC con 3 o 5 vettori genera una tavolozza variegata di colori combinatorie, consentendo il monitoraggio di molteplici singoli cloni HSPC.
Contrassegnato HSPC combinato con nuova tecnologia di imaging permesso di tracciare individuale homing HSPC e attecchimento nel BM di topi irradiati. Vettori lego sono stati usati per marcare HSPC con 3 o 5 diversi fps (da Cerulean, eGFP, Venere, tdTomato, e mCherry) e seguire il loro attecchimento nel tempo nel BM mediante microscopia confocale e 2-fotone, consentendo la visualizzazione chiara delle ossa e di altri strutture a matrice, e la relazione di cloni HSPC ai componenti del loro microambiente. HSPC sono stati purificati come le cellule negative lignaggio da C57Bl / 6 topi BM, trasdotte con vettori lego, e reinfuse tramite iniezione vena della coda in topi congenici mielo-ablato. Monitorando grandi volumi del tessuto sterno BM abbiamo visualizzato attecchimento endostale si verificano primaRigenerazione BM. Gruppi di cellule con spettri di colore diversi apparso inizialmente in prossimità all'osso e progredito a livello centrale nel corso del tempo. È interessante notare che, dopo più di 3 settimane il midollo costituito da ammassi clonali macroscopici, suggerendo diffusione della emopoiesi derivati dalle singole HSPCs contiguo nel midollo, invece di ampia diffusione HSPCs attraverso il flusso sanguigno. C'era meno diversità di colore in momenti in ritardo, suggerendo difficoltà di trasduzione a lungo termine ripopolare le cellule con più vettori.
Inoltre, HSPCs formata cluster nella milza, un organo responsabile anche per emopoiesi nei topi. Singole celle HPSC-derivati potrebbero essere risolti nel timo, linfonodi, milza, fegato, polmoni, cuore, pelle, muscolo scheletrico, tessuto adiposo, e reni pure. Le immagini 3D possono essere valutati qualitativamente e quantitativamente per apprezzare la distribuzione di cellule con perturbazioni minime dei tessuti. Infine, illustriamod la fattibilità di studi dinamici live in 4D, combinando multifotonica scansione di risonanza e confocale time-lapse imaging. Questa metodologia consente non invasiva alta risoluzione, multidimensionale cellula-destino tracciato di spettralmente contrassegnati cellule popolazioni nella loro architettura 3D intatta, fornendo un potente strumento per lo studio della rigenerazione dei tessuti e della patologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui i dettagli di una potente metodologia recentemente messo a punto per il monitoraggio cellulare clonale, che unisce la grande diversità generata contrassegnando con-5FP codifica vettori Lego e l'imaging confocale con tandem e microscopia a 2 fotoni per ottenere volumetrico e l'imaging dinamico in tessuti vivi combinatorio. Questo ha esteso l'uso della marcatura registrando confocale identità spettrale in 5 "distinti" canali a 8-bit di colore a base di FP. Così il relativo rapporto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
