Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Summary

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is <30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Abstract

Eerder beschreven mitochondriale isolatiemethoden middels differentiële centrifugatie en / of Ficoll gradiënt centrifugatie vereisen 60 tot 100 minuten in beslag. We beschrijven een werkwijze voor de snelle isolatie van mitochondria van zoogdieren biopten met een commercieel tissue Dissociator en differentiële filtratie. In dit protocol wordt manueel homogenisering vervangen door gestandaardiseerde homogenisering cyclus het weefsel Dissociator's. Dit zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. Na weefsel dissociatie, wordt het homogenaat gefilterd door nylon mesh filters, die repetitieve centrifugeren stappen te elimineren. Hierdoor kan mitochondriale isolatie worden uitgevoerd in minder dan 30 minuten. Deze isolatie protocol levert ongeveer 2 x 10 ¹⁰ levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria van 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht) weefselmonster.

Introduction

Mitochondriën bestaan ​​in elke cel in het lichaam behalve rode bloedcellen en zijn betrokken bij een groot aantal belangrijke cellulaire en metabole processen ^1-4. Door deze vele functies kunnen mitochondriale schade nadelige gevolgen ³ hebben. Om mitochondriale functie en dysfunctie verschillende mitochondriale isolatiemethoden onderzoeken zijn beschreven. De vroegste gepubliceerde rekeningen van mitochondriale isolatie datum om de jaren 1940 ^5-8. De eerste gedocumenteerde poging aangetoond mitochondriale isolatie door malen leverweefsel in een mortier gevolgd door centrifugatie in een zoutoplossing bij lage snelheid ^5,8. Later, andere groepen uitgebreid op de oorspronkelijke procedure en gedemonstreerd weefsel fractionering op basis van differentiële centrifugatie ^6-8. Deze vroege methoden vormde de basis van de huidige technieken die vaak nemen homogenisering, en / of differentieel centrifugeren ^9-15. Het aantal homogenizatiop en centrifugatiestappen varieert tussen protocollen. Deze repetitieve stappen verhogen de tijd voor mitochondriële isolatie en uiteindelijk levensvatbaarheid verminderen. Daarnaast kunnen handmatige homogenisering mitochondriale schade en inconsistente resultaten veroorzaken als ze niet goed gecontroleerd ^10,16.

Onlangs, gebruikten we homogenisering en differentiële centrifugatie om mitochondriën voor transplantatie te isoleren in hartspierweefsel ^17,18. Deze langdurige isolatie procedure vereist ongeveer 90 min en de klinische toepasbaarheid van deze methode was dus beperkt. Met het oog op acute therapeutisch gebruik in klinische en chirurgische behandeling hebben we een snelle mitochondriale isolatieprocedure die in minder dan 30 min kan worden uitgevoerd ontwikkeld.

De belangrijkste voordelen van dit protocol is dat gestandaardiseerde weefsel dissociatie zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. In addition, het gebruik van differentiële filtratie in plaats van differentiële centrifugatie elimineert tijdrovend en repetitief centrifugatiestappen waardoor meer snelle isolatie van zeer gezuiverd, levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria.

Het vermogen om levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria isoleren in minder dan 30 minuten maakt klinische toepasbaarheid. Deze isolatie protocol heeft potentieel voor gebruik in een coronaire bypass operatie chirurgie (CABG) en andere therapeutische procedures.

Protocol

Voorbereiding Bereid 1 M K-HEPES Stock Solution (pas pH op 7,2 met KOH). Bereid 0,5 M K-EGTA Stock Solution (pas pH op 8,0 met KOH). Bereid 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution. Bereid 1 M MgCl2 voorraadoplossing. Bereid Homogenisatie Buffer (pH 7,2) 300 mM sucrose, 10 mM K-HEPES en 1 mM K-EGTA. Bewaren bij 4 ° C. Bereid Ademhaling buffer 250 mM sucrose, 2 mM KH 2PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) e…

Representative Results

Een figuur waarin de procedurele stappen in de isolatie van mitochondriën met weefsel dissociatie en differentiële filtratie wordt getoond in figuur 1. Totale procedure is minder dan 30 minuten. Weefsel monsters werden verkregen met een 6 mm punch biopsie. Tissue gewicht bedroeg 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht). Het aantal mitochondria geïsoleerd zoals bepaald door deeltjesgrootte telling bedroeg 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitochondria voor skeletspieren…

Discussion

Met succes isoleren mitochondria met dit protocol is het essentieel om alle oplossingen en weefselmonsters op ijs houden mitochondriale levensvatbaarheid behouden. Zelfs wanneer op ijs wordt geïsoleerde mitochondria een afname van functionele activiteit vertonen in de tijd ^19. We raden aan dat alle oplossingen en aanvullingen vooraf worden voorbereid. We vooraf wegen en te bewaren Subtilisine A in 4 mg aliquots in 1,5 ml microfuge buizen en opgeslagen bij -20 ° C. Evenzo BSA is pre-gewogen en opgeslagen in …

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110