Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma
Summary
Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika – Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla <30 dk.
Abstract
Diferansiyel santrifüjleme ve / veya, Ficoll gradyan santrifüj kullanılarak daha önce anlatıldığı mitokondriyal izolasyon yöntemleri tamamlamak için 60-100 dakika gerektirir. Bir ticari doku Dissociator ve ayırıcı filtrasyon kullanılarak memeli biyopsilerinden mitokondri hızlı izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, el homojenleştirme doku ayrıştırıcı, en standart homojenizasyon döngüsü ile değiştirilir. Bu düzgün ve kolay bir manuel homojenizasyon ile elde edilemez doku tutarlı bir homojenizasyon işleminin uygulanmasına izin verir. Doku ayrışma sonra, homojenat tekrarlanan santrifüj adımları ortadan naylon örgü filtreler aracılığıyla filtre edilir. Bunun bir sonucu olarak, yalıtım mitokondriyal az 30 dk içinde gerçekleştirilebilir. Bu izolasyon protokol 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık) ya da doku numunesinden yaklaşık 2 10 x 10 uygulanabilir ve solunum yetkili mitokondri verir.
Introduction
Mitokondri kırmızı kan hücreleri hariç, vücuttaki her hücrede mevcuttur ve önemli hücresel ve metabolik süreçleri 1-4 arasında bir sayıda katılmaktadırlar. Çünkü bu birçok fonksiyonun, mitokondriyal hasar zararlı etkileri 3 olabilir. Mitokondriyal fonksiyon ve disfonksiyonu birkaç mitokondriyal izolasyon yöntemleri araştırmak amacıyla tarif edilmiştir. 1940'larda 5-8 mitokondriyal izolasyon tarihten erken yayınlanmış hesaplar. Ilk belgelenmiş girişim düşük hızda 5,8 bir tuz çözeltisi içinde ve ardından merkezkaçlama uygulanarak, bir havan içinde karaciğer doku öğüterek mitokondriyal izolasyonu gösterdi. Daha sonra, diğer gruplar orijinal prosedürü üzerine genişletilmiş ve diferansiyel santrifüj 6-8 dayalı doku ayrımlaştığını gösterdi. Bu ilk yöntemlerin sık sık homojenizasyon ve / veya diferansiyel santrifüj 9-15 dahil güncel tekniklerin temelini oluşturmuştur. Homogenizati sayısıadımlar ve santrifüj protokolleri arasında değişir. Bu tekrarlı adımlar mitokondriyal izolasyon süresini artırmak ve sonuçta canlılığını azaltır. Düzgün 10,16 kontrollü değilse Ayrıca, manuel homojenizasyon mitokondriyal hasar ve tutarsız sonuçlara neden olabilir.
Son zamanlarda, biz miyokard dokusu 17,18 içine nakli için mitokondri izole etmek için homojenizasyon ve diferansiyel santrifüj kullanılır. Bu izolasyon prosedürü, uzun, yaklaşık 90 dakika gerekli ve bu yöntemin klinik uygulanabilirliği dolayısıyla sınırlı kalmıştır. Klinik ve cerrahi tedavi akut terapötik kullanım için izin vermek için daha az bir süre, 30 dakika içinde yapılabilir hızlı bir mitokondriyal izolasyon işlemi geliştirdik.
Bu protokolün büyük faydalar standart doku ayrışma üniforma ve kolayca manuel homojenizasyon ile elde edilmez doku tutarlı homojenizasyon için izin verdiğini vardır. Additiyon, diferansiyel santrifüj yerine diferansiyel filtrasyon kullanımı zaman alıcı ve son derece saflaştırılmış yaşayabilir ve solunum yetkili mitokondri daha hızlı izolasyonu için izin tekrarlayan santrifüj adımları ortadan kaldırır.
30 dakikadan az yaşayabilen ve solunum yetkili mitokondri izole yeteneği klinik uygulanabilirlik sağlar. Bu izolasyon protokol koroner arter bypass cerrahisi (KABG) ve diğer tedavi işlemlerinde kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarıyla mitokondriyal canlılığını korumak için buz üzerinde tüm çözümleri ve doku örnekleri tutmak için önemli olan bu protokolü kullanarak mitokondri izole etmek için. Buz üzerinde muhafaza bile, izole mitokondri zaman 19 vasıtasıyla işlevsel aktivitesinde bir azalma sergiler. Hepimiz çözümleri ve eklemeler önceden hazırlanmış öneririz. Biz önceden tartılır ve 1.5 ml mikrofüj tüpler 4 mg parçalar halinde saklayın ve subtilisin A -20 ° C'de saklayın. Benzer şekild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL 103542, ve CAP için BCH Anestezi Araştırma Vakfı'nın Değerli Malibu Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
