Rapid isolering og rensing av Mitokondrier for transplantasjon Av Tissue Dissosiasjon og differensial Filtration

Summary

En fremgangsmåte for hurtig isolering av mitokondrier fra pattedyr vevsbiopsier er beskrevet. Rottelever, eller skjelettmuskelpreparater ble homogenisert med en kommersiell vev dissociator og mitokondrier ble isolert ved filtrering gjennom nylon differensial mesh filter. Mitokondrie isolasjon tid er <30 min sammenlignet med 60 – 100 min ved hjelp av alternative metoder.

Abstract

Tidligere beskrevne mitokondrielle isoleringsmetoder ved hjelp av differensialsentrifugering og / eller Ficoll gradientsentrifugering krever 60 til 100 minutter å fullføre. Vi beskriver en fremgangsmåte for rask isolering av mitokondrier fra pattedyr biopsier ved hjelp av en kommersiell vev dissociator og differensial filtrering. I denne protokollen, er manuell homogenisering erstattet med vevet dissociator standardiserte homogenisering syklus. Dette sørger for en enhetlig og konsistent homogenisering av vevet som ikke er lett oppnås med manuell homogenisering. Etter vev dissosiasjon, blir homogenat ble filtrert gjennom nylon mesh filter, som fjerner gjentatt sentrifugering trinn. Som et resultat, kan mitokondriell isolering utføres i mindre enn 30 min. Denne isolasjonen protokollen gir ca 2 x ¹⁰ 10 levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier fra 0,18 ± 0,04 g (våtvekt) vevsprøve.

Introduction

Mitokondrier eksistere i hver eneste celle i kroppen, bortsett fra røde blodceller og er involvert i et stort antall viktige cellulære og metabolske prosesser ^1-4. På grunn av disse mange funksjoner, kan mitokondrieskade ha skadelige effekter ^tre. For å undersøke mitokondriefunksjon og dysfunksjon flere mitokondrielle isoleringsmetoder har blitt beskrevet. De tidligste publiserte kontoer mitokondriell isolasjon dato til 1940-tallet ^5-8. Den første dokument forsøk demonstrerte mitokondriell isolert ved maling av levervev i en morter, etterfulgt av sentrifugering i en saltoppløsning ved lav hastighet ^5,8. Senere, andre grupper utvidet på den opprinnelige prosedyren og demonstrert vev fraksjonering basert på differensialsentrifuge ^6-8. Disse tidlige metoder dannet basis av dagens teknikker, som benytter ofte homogenisering, og / eller differensialsentrifuge ^9-15. Antallet homogenizatipå og sentrifuge trinn varierer mellom protokoller. Disse repeterende trinn øke tiden for mitokondriell isolasjon og til slutt redusere levedyktighet. I tillegg kan manuell homogenisering forårsake mitokondriell skade og inkonsistente resultater hvis ikke skikkelig kontrollert ^10,16.

Nylig brukte vi homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere mitokondrier for transplantasjon til hjerteinfarkt vev ^17,18. Denne omstendelige isoleringsprosedyre kreves omtrent 90 min, og den kliniske anvendbarheten av denne metoden var derfor begrenset. For å tillate for akutt terapeutisk bruk i kliniske og kirurgiske behandlingen har vi utviklet en hurtig mitokondriell isolasjon prosedyre som kan utføres i mindre enn 30 min.

De store fordelene med denne protokollen er at standardiserte vev dissosiasjon gir jevn og konsistent homogenisering av vev som ikke er enkelt å oppnå med manuell homogenisering. I addition, bruk av differensial filtrering i stedet for differensialsentrifugering eliminerer tidkrevende og gjentatt sentrifugering fremgangsmåte som muliggjør hurtig isolering av mer høyrensede, levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier.

Evnen til å isolere levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier på mindre enn 30 min muliggjør klinisk anvendbarhet. Denne isolasjonen protokollen har potensial for bruk i koronarkirurgi (CABG) og andre terapeutiske prosedyrer.

Protocol

Forberedelse Forbered en M K-HEPES Stock Solution (justere pH til 7,2 med KOH). Forbered 0,5 M K-EGTA Stock Solution (justere pH til 8,0 med KOH). Forbered en M KH 2 PO 4 Stock Solution. Forbered en M MgCl2 Stock Solution. Forbered homogenisering buffer (pH 7,2) 300 mM sukrose, 10 mM K-HEPES og 1 mM K-EGTA. Oppbevar ved 4 ° C. Forbered Respiration buffer 250 mM sukrose, 2 mM KH PO 2 4, 10 mM MgCl 2, 20 mM…

Representative Results

En figur som beskriver de prosedyremessige trinn i isoleringen av mitokondria ved anvendelse av vev dissosiasjon og differensial filtrering er vist i figur 1. Totalt prosesstiden er mindre enn 30 min. Vevsprøver ble oppnådd ved bruk av en 6 mm hull biopsi. Tissue vekt var 0,18 ± 0,04 g (våt vekt). Antallet mitokondriene isolert som bestemt ved telling partikkelstørrelse var 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondriene til skjelettmuskel og 2,75 x …

Discussion

Å kunne isolere mitokondrier ved hjelp av denne protokollen er det viktig å holde alle løsninger og vevsprøver på is for å bevare mitokondrie levedyktighet. Selv når det holdes på is, vil det isolerte mitokondrier utviser en reduksjon i funksjonell aktivitet over tid ^19. Vi anbefaler at alle løsninger og tillegg være forhånds forberedt. Vi pre-veie og lagre subtilisin A i 4 mg porsjoner i 1,5 ml mikrofugerør og lagre dem ved -20 ° C. Tilsvar BSA er pre-veid og lagret i 20 mg aliquoter i 1,5 ml mi…

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110