Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Summary

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Abstract

Gefrierbruch-/ Gefrier Etch beschreibt einen Prozess, bei dem Proben, in der Regel biologische oder Nanomaterialien in der Natur, werden eingefroren, zerbrochen, und repliziert werden, um ein Kohlenstoff / Platin für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie "cast" beabsichtigt. Proben werden ultraschnellen Gefriergeschwindigkeiten unterworfen, oft in Gegenwart von Kryoschutzmitteln Eiskristallbildung zu begrenzen, mit anschließendem Brechen der Probe in flüssigem Stickstoff gekühlten Temperaturen im Hochvakuum. Die resultierenden gebrochenen Oberfläche repliziert und durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin aus einem Winkel, der Oberfläche verleiht dreidimensionalen Detail auf die Guss stabilisiert. Diese Technik hat sich als besonders aufschlussreich für die Untersuchung von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen bewährt und hat sich für das Verständnis der Zellform zu verwandten Zellfunktion bei. In diesem Bericht, die Geräteanforderungen und technisches Protokoll für die Durchführung überblicken wirGefrierbruch, der zugehörige Nomenklatur und Eigenschaften der Bruchflächen, Variationen über das herkömmliche Verfahren und Kriterien für die Interpretation der Gefrierbruch-Bilder. Diese Technik wurde häufig für ultrastrukturelle Untersuchung in vielen Bereichen der Zellbiologie und hält Versprechen als eine aufstrebende bildgebendes Verfahren für die molekulare, Nanotechnologie und Materialwissenschaften Studien.

Introduction

Das Konzept und die praktische Anwendung der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben wurde von Steere ¹ mehr als die Hälfte vor einem Jahrhundert eingeführt. Die frühe Gerät angeeignet unterschiedlichen Komponenten in einem Arbeits geschlossene Einheit ^1. Die ursprüngliche Vorrichtung wurde modifiziert, und um die kritische Notwendigkeit für die Fernmanipulation, Wartung von Hochvakuum aufzunehmen in handelsübliche Instrumente raffiniert, und die Verdampfung von Kohlenstoff und Metallen, um eine geeignete Prüfungs durch Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung Replik zu erzeugen 2).

Das typische Instrument besteht aus einer Hochvakuumkammer mit Probentisch und Mikrotom Arm mit regelbaren flüssigem Stickstoff Durch (Abbildung 1). Die Kammer beinhaltet auch zwei Elektronenkanonen, einer zum Stabilisieren Kohlenstoffverdampfung bei 90 ° Winkel zu dem Objekttisch und der andere für plati positioniertnum / Kohlenstoff-Shadowing in einem einstellbaren Winkel, in der Regel 15 ° – 45 ° (Abbildung 2). Stromversorgung des Gerätes wird angewendet, um die Vakuumpumpe zu betreiben und elektronische Tafeln regeln Temperatureinstellung und Elektronenkanone Kontrolle.

Ursprünglich als Mittel gedacht, um eine verbesserte Abbildung von Viren zu erreichen, Gefrierbruch als eine Technik für die Untersuchung und Analyse von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen ^{2, 3} gewonnen noch mehr Popularität. In der Tat hat dieses Verfahren schon fester Bestandteil der Aufklärung Struktur / Funktions-Beziehungen in Zellen und Geweben, und viele dieser Studien stehen als klassische Beiträge zur Zell-und Molekularbiologie ^4-9. Das Hauptziel und Gründe für die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik war Artefakte beobachtbar elektronenmikroskopischen Auflösung, die sich aus chemischen Fixierung und Verarbeitung in herkömmlichen biologischen Elektronenmikroskopie begrenzen. Hier ist das Ziel, chemisch zu begrenzenFixierung und die Probe mit ausreichender Geschwindigkeit und häufig in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, um die Bildung von Eiskristallen und andere Einfrieren Artefakte begrenzen einzufrieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik ein Wiederaufleben des Interesses von Molekularbiologen und Materialwissenschaften Ermittler zur Untersuchung von Nanopartikeln und Nanomaterialien gefunden.

Gefrierbruch-und gefrier Etch Bilder zeigen einen dreidimensionalen Charakter und manchmal irren für rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen. Jedoch sind Gefrierbruch-Zubereitungen durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht und ihre wichtigen Beitrag zur Hochauflösung morphologische Studien ist ihre eindeutige Darstellung der Struktur / Funktionselemente der Zellmembranen. Gefrierbruch-Verarbeitung wird durch Einfrieren von Zellen und Geweben mit ausreichender Geschwindigkeit, um Eis Kristallisation und / oder mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin begrenzen eingeleitet. Die Proben werden anschließend unter Vakuum und einem Vertreter gebrochenLICA durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin auf der Bruchfläche erzeugt. Die ursprüngliche Probe wird von der Replik, die auf einem Standard-EM Objektgitter abgerufen wird verdaut. Ein weiterer häufiger Fehlinterpretation der Gefrierbruch-Bilder ist, dass sie den Zelloberflächen darzustellen. Jedoch ist die Grundprämisse der Gefrierbruch ist, dass biologische Membranen durch die Lipiddoppelschicht durch die Bruchverfahren (3) aufgeteilt. Dieser Prozess in biologischen Membranen ergibt zwei Bruchflächen, eine, die die Organisation der Hälfte der Membran benachbart zu dem Zytoplasma, der PF-Fläche zeigt, und eine, die die Hälfte der bimolekularen Membranschicht, die angrenzend an die extrazelluläre ist enthüllt Milieu, das EF-Gesicht. Wahre Zelloberflächen sind nicht Gefrierbruch Bilder dargestellt, sondern nur angezeigt werden, wenn der nachfolgende Schritt hinzugefügt gefrier Radierung nach der Bruchverfahren verwendet wird. Um effektiv zu ätzen zuvor gebrochen Proben Oberfläche detai zeigenl, müssen Proben mit einer schnellen Rate und ohne unetchablecryoprotectant eingefroren werden. Ätzen von Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe enthüllt zugrunde liegenden Funktionen wird durch Positionieren des Kühl Mikrotom Arm über dem Probentisch Erzeugen einer Temperaturdifferenz zwischen der Phase hält die Probe und die Kühl Mikrotom Arm, der bewirkt, daß Wasser von der Oberfläche sublimieren erreicht. Wird Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe während des Gefriert Ätzen Manöver sublimiert, kann Aspekte der aktuellen Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix, Cytoskelett-Strukturen und Molekularanordnungen mit hoher Auflösung offenbart. So Gefrierbruch und gefrier Etch sind nicht austauschbare Begriffe, sondern spiegeln eine schrittweise Prozess von denen die letztere kann nicht je nach den Bedürfnissen der jeweiligen Studie notwendig oder wünschenswert sein.

Nach dem Gefrierbruch-/ Gefrier Ätzverfahren, die Bruchflächen sind zu richten Verdampzogentive Mäntel aus Kohlenstoff und Platin, um die Unterstützung und Imaging Gegensatz zu der Replik bieten. Das Platin / Kohlenstoff Abbildungsverdampfung kann unidirektional oder Dreh und wird entweder durch Widerstand oder Elektronenkanonen erfolgt. Unidirektionale Abschattung von einem bekannten Winkel, typischerweise 30 ° – 45 °, ist nützlich bei der Durchführung bestimmter morphometrische Berechnungen. Exemplare, die zu tief Ätzen unterzogen worden sind, in der Regel sind Dreh beschattet und die resultierenden Bilder dieser Proben sind fotografisch für die Bewertung umgekehrt.

Die historische sowie ein Ziel der vorliegenden Gefrierbruch-/ Gefrier Ätztechnik ist die chemische Fixierung und Verarbeitung Probe Artefakte, die mit mehr konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie Verfahren verbunden sind, begrenzen. Allerdings bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil in der Fähigkeit, dreidimensionale Detail verleihen und damit Erwerb von morphometrischen Daten in biologischen, Materialwissenschaften zu erleichtern, und nanotechnology Proben. Gefrierbruch-und gefrier Etch Verfahren sind komplex und vielschichtig und einige Aspekte ihrer Anwendung zugeschnitten sind. Diese Präsentation gibt einen Überblick Ansicht der wichtigsten Funktionen des Prozesses und der Leser wird auf umfassende veröffentlichten Protokollen ^{10, 11,} um die Details anzugehen und gestalten den Prozess für bestimmte Forschungsbedarf bezeichnet.

Protocol

1. Herstellung von biologischen Proben für Gefrierbruch-/ Gefrier Etch Verwenden eines herkömmlichen EM Fixiermittelformulierung wie 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. Primär Fixierung von biologischen Geweben durchzuführen. HINWEIS: Während es wünschenswert, einige Arten von Proben ohne vorherige Fixierung einzufrieren, Universal Blut übertragene Krankheitserreger Vorsichtsmaßnahmen Mandat entsprechende Fixierung, wo die Probe aus menschlichem Gewebe. …

Representative Results

Der Schlüssel Prämisse der Gefrierbruch-Bild Interpretation ist, dass Bruchflächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen verleihen beiden Bruchflächen, durch das Übereinkommen der PF-Fläche (Plasma-Fraktur-face) und EF-Gesicht (extrazelluläre Fraktur-face) (Abbildung genannt geben 3). Der PF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das Zytoplasma der Zelle und der EF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das extrazelluläre M…

Discussion

In den Jahren nach seiner Einführung und kommerzielle Verfügbarkeit, Gefrierbruch / Etch Verfahren wurden häufig für Untersuchungen der biologischen Membran-Struktur genutzt. In der Tat haben die besten Perspektiven der einige der strukturellen Spezialisierungen von Membranen in der Gefrierbruch / Etch Präparate erhalten. Diese Studien nicht nur dazu beigetragen, das Verständnis der strukturellen Organisation der Membranen, sondern auch Einblicke in Struktur und Funktion bezogen sind.

…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.