Summary
São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.
Abstract
Freeze-fratura / congelar-etch descreve um processo pelo qual as amostras, normalmente biológica ou nanomaterial na natureza, são congelados, fraturado, e replicado para gerar um carbono / platina "cast" destina-se a exame de microscopia eletrônica de transmissão. As amostras são sujeitas a taxas de congelamento ultra-rápidos, muitas vezes na presença de agentes crioprotectores para limitar a formação de cristais de gelo, com subsequente fractura da amostra em azoto líquido temperaturas arrefeceu-se sob alto vácuo. A superfície de fractura resultante é replicado e estabilizado por meio de evaporação de carbono e platina a partir de um ângulo que confere a superfície pormenor tridimensional para o fundido. Esta técnica tem se mostrado particularmente esclarecedor para a investigação das membranas celulares e suas especializações e contribuiu consideravelmente para a compreensão da forma celular para a função das células relacionadas. Neste relatório, examinamos as exigências do instrumento e protocolo técnico para a realização decongelar-fratura, a nomenclatura e as características dos planos de fratura associada, variações sobre o procedimento convencional e os critérios de interpretação de imagens de congelamento e fratura. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a investigação ultra-estrutural em muitas áreas da biologia celular e promete ser uma técnica de imagem molecular para emergentes, nanotecnologia, e os estudos de ciência dos materiais.
Introduction
O conceito e aplicação prática do processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas foi introduzido por uma Steere mais de meio século atrás. O aparelho cedo apropriou componentes díspares em uma unidade auto-suficiente trabalhar um. O aparelho inicial foi modificado e refinado em instrumentos comercialmente disponíveis, a fim de acomodar a necessidade crítica para a manipulação remota, manutenção de alto vácuo, e a evaporação do carbono e metais para produzir uma réplica apropriada para exame por microscopia electrónica de transmissão (Figura 1 e Figura 2).
O aparelho típico é constituído por uma câmara de alto vácuo e com o quadro de amostra braço micrótomo com débitos reguláveis de azoto líquido (Figura 1). A câmara também abriga dois canhões de electrões, um estabilizante para a evaporação de carbono posicionados em um ângulo de 90 ° para a fase da amostra e o outro por platinum / carbono sombreamento num ângulo ajustável, tipicamente 15 ° - 45 ° (Figura 2). A alimentação da unidade é aplicada para operar a bomba de vácuo e painéis eletrônicos regular de ajuste de temperatura e eletrônica de controle de armas.
Originalmente concebido como um meio para alcançar uma melhor imagem de vírus, congelar-fratura ganhou ainda mais popularidade como uma técnica para o exame e análise das membranas celulares e suas especializações 2, 3. Na verdade, este procedimento tem sido parte integrante da elucidação das relações de estrutura / função em células e tecidos e muitos desses estudos se apresentam como contribuições clássicas para biologia celular e molecular 4-9. O principal objetivo e justificativa para o desenvolvimento da técnica de congelamento e fratura era limitar artefatos observáveis no elétron resolução microscópica decorrente da fixação química e processamento utilizado em microscopia eletrônica biológico convencional. Aqui o objectivo é limitar a químicaa fixação e para congelar as amostras com uma velocidade suficiente e muitas vezes na presença de um agente crioprotector de modo a limitar a formação de cristais de gelo e outros artefactos de congelamento. Mais recentemente, esta técnica tem encontrado um ressurgimento do interesse de biólogos moleculares e investigadores de ciência dos materiais para exame de nanopartículas e nanomateriais.
Freeze-fratura e congelar-etch imagens apresentam um caráter tridimensional e, por vezes, são confundidos com microscopia eletrônica de varredura. No entanto, os preparativos criofratura são examinados por microscopia eletrônica de transmissão e sua grande contribuição para os estudos morfológicos de alta resolução é a sua representação única de elementos estrutura / função das membranas celulares. Processamento de fractura por congelação é iniciada por células e tecidos de congelação com uma velocidade suficiente para limitar a cristalização do gelo e / ou com o uso de agentes crioprotectores, tais como glicerol. As amostras são então fraturado sob vácuo e um representantelica é gerado pela evaporação de carbono e platina sobre a superfície fracturada. A amostra original foi digerido a partir de réplicas, que é recuperado dentro de uma grade de amostra padrão EM. Outra má interpretação comum de imagens criofratura é que eles retratam superfícies celulares. No entanto, a premissa básica da congelação-fractura é que as membranas biológicas são divididos através da bicamada lipídica do processo de fractura (Figura 3). Este processo em membranas biológicas produz duas faces, uma fractura que revela a organização da metade da membrana adjacente ao citoplasma, o PF-cara, e uma que revela a metade do folheto bimolecular da membrana que está adjacente ao extracelular meio, a EF-face. Superfície das células não são verdadeiras imagens representadas em freeze-fracture mas só aparecem quando o passo subsequente adicionado de gelo-água-forte, seguindo o procedimento fractura é usado. A fim de gravar efetivamente espécimes previamente fraturadas para revelar detai superfíciel, as amostras devem ser congeladas a uma taxa rápida e sem unetchablecryoprotectant. Etching de água a partir da superfície do espécime fracturadas que revelem características subjacentes é conseguido através do posicionamento do braço micrótomo arrefecimento durante a fase de amostra criando um diferencial de temperatura entre a fase, com o modelo e o braço micrótomo de arrefecimento que faz com que a água a sublimar a partir da superfície. Quando a água é sublimada a partir da superfície do espécime fracturados durante a manobra de gravura congelação, em seguida, os aspectos de superfícies celulares reais, matriz extracelular, as estruturas do citoesqueleto e montagens moleculares pode ser revelada em alta resolução. Assim congelar-fratura e congelá-etch não são termos intercambiáveis mas refletem um processo passo a passo o último dos quais pode não ser necessário ou desejável, dependendo das necessidades do estudo particular.
Após a fratura freeze / freeze-etch procedimentos, as superfícies fraturadas são submetidos a evapora dirigidostiva camadas de carbono e platina, a fim de fornecer suporte e imagem contraste com a réplica. A evaporação de imagem / carbono platina pode ser unidirecional ou rotativo, e é realizado por qualquer resistência ou canhões de elétrons. Sombreamento unidirecional de um ângulo conhecido, tipicamente 30 ° - 45 °, é útil na realização de certos cálculos morfométricos. As amostras que foram submetidas a deep-etching normalmente são rotativos sombreado e as imagens resultantes destes espécimes são fotograficamente revertida para avaliação.
O histórico, bem como uma meta presente da criofratura / congelar-etch técnica é limitar a fixação química e processamento das amostras de artefatos que estão associados com mais procedimentos de microscopia eletrônica de transmissão convencional. No entanto, esta técnica proporciona uma vantagem substancial em sua capacidade de conferir detalhe tridimensional e, assim, facilitar a aquisição de dados morfométricos em biológicas, ciência dos materiais, e nespécimes anotechnology. Procedimentos criofratura e congelar-etch são complexas e multi-facetada e alguns aspectos de sua aplicação são personalizados. Esta apresentação oferece uma visão levantamento das principais características do processo e remete-se a protocolos publicados abrangentes 10, 11 a fim de resolver os detalhes e personalizar o processo para as necessidades específicas de pesquisa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Preparação de amostras biológicas para Freeze-fratura / Freeze-etch
- Use uma formulação fixador EM convencional, tal como o glutaraldeído a 2% + 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. para realizar a fixação primária de tecidos biológicos. Nota: Embora possa ser desejável para congelar alguns tipos de amostras sem fixação prévia, de agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue precauções universais obrigar a fixação adequada em que a amostra consiste de tecido humano.
- A seguir à fixação primária, enxaguar a amostra no mesmo tampão suplementado com sacarose a 0,2 M para não mais do que 1 hora.
- Transfira a amostra a uma solução de agente crioprotector consiste em 25% de glicerol em tampão fosfato 0,1 M, para não mais do que 1 hora.
2. congelação e armazenamento de amostras de antecedência da Freeze-fratura
- Seleccionar os espécimes de ouro ou de cobre topos de tamanho e forma para a amostra adequada a ser processado (Figura 4
- Usando fórceps fino grau e / ou calibre pequeno posição agulhas de seringa pequenos fragmentos da amostra na parte superior de um topo da amostra de metal.
- Reduzir o teor de líquido da amostra para um pegajoso, ligeiramente cola como a consistência, a tiragem de líquidos a partir do bordo do topo com o papel de filtro.
- Para réplicas individuais, use agulhas de pequeno calibre seringa para criar um monte de tecido no topo. Por duas vezes réplicas, inverter outro toco e posicioná-lo exatamente sobre o topo e coloque levemente na superfície da amostra a criação de um sanduíche (Figura 5A). Não pressione a amostra para fora entre os dois tocos.
- Encha dois vasos Dewar isolados com nitrogênio líquido. NOTA: O primeiro recipiente acomoda um poste de metal contendo um pequeno poço que é utilizado para liquefazer um pequeno volume de gás propano de um cilindro disponível comercialmente (Figura 5B). O segundo navio é um armazenamento particionado / navio segurando para brevely manter espécimes congelados com nitrogênio líquido.
- Utilizando o cilindro de bocal posicionada dentro do poço de propano, abrir a válvula do cilindro e permitem que o gás flua para o poço do primeiro vaso em que vai liquefazer. NOTA: CUIDADO !! PROPANE é explosivo, PODE CAUSAR LESÕES NO CONGELAMENTO contato e é um asfixiante. Use propano apenas em uma capa química certificada para tal uso cuidando também para evitar fontes de ignição estranhos, usando vestuário de protecção das temperaturas baixas, e manter a ventilação adequada.
- Tão rapidamente quanto possível, pegar o modelo de montagem com uma pinça de grão fino e mergulhá-la no gás liquefeito no primeiro navio por alguns segundos, em seguida, transferir rapidamente para o segundo reservatório de retenção de nitrogênio líquido (Figura 5B).
- Uma vez que as amostras são congeladas, loja sob nitrogênio líquido até o momento de transferir para a fábrica de gelo-fratura. Transfira os tocos para um nitrogênio líquido recipiente Dewar maior de armazenamento para prorrogadoarmazenamento, se desejar, no entanto o cuidado deve ser tomado para não permitir que os tocos para descongelar.
3 Operação da fratura Congelar Instrumento e Specimen Processing
- Carregando espécimes no suporte de latão e para a câmara
- Coloque os topos de amostras de ouro em um suporte de amostra dupla réplica do tipo brochura ou dispositivo de fixação sob nitrogênio líquido e manter lá até a hora de colocar na câmara da amostra (Figura 6).
- Quando a câmara tenha atingido alto vácuo (cerca de 2 x 10 -6 mbar) e a fase de ter sido arrefecido até à temperatura de azoto líquido, desligar a bomba, a câmara de ventilação, e posicionar os espécimes montados tocos para a mesa de amostra tão rapidamente quanto possível .
- Ligar a bomba, restabelecer a alto vácuo, e usar fase e temperatura braço controlos electrónicos para ajustar a temperatura da amostra de tabela de -100 ° C e azoto líquido directamente para o braço micrótomo e bring que a temperatura do azoto líquido.
- O processo de fratura
- Ao atingir alto vácuo, uma temperatura de -100 ° C fase e braço microtome à temperatura do azoto líquido, abrir remotamente o titular duplo réplica espécime fraturando assim as amostras sobre as montagens de amostras (freeze-fracture_movie1.mov).
- No caso de espécimes destinados a seguinte fractura gravura, utilizar uma lâmina mantida num grampo no braço micrótomo para raspar (isto é, fractura) a superfície das amostras, em vez do passo 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov).
- Se o passo de gravura congelamento é adicionado para ser executada, posicionar o braço micrótomo arrefecida sobre as superfícies fracturadas por um a vários minutos. NOTA: Esta manobra sublima (ie, etch) água da superfície fraturada. O efeito desta manobra é o de revelar verdadeiras superfícies celulares, matriz extracelular, e / ou agrupamentos moleculares por sublimação de água, em adição a fracture caras que passa através da bicamada lipídica das membranas.
- Sombreamento de metal e suporte réplica evaporação usando canhões de elétrons
- Ative a arma platina / elétron de carbono ou de resistência e permitir que ele se evapore uma camada fina (cerca de 2 nm) de platina / carbono sobre a superfície de fratura de um ângulo de 30 ° - 45 °. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg.
- Ative o elétron de carbono ou arma de resistência como no passo 3.3.1 e evaporar uma fina camada de carbono para a superfície da amostra fraturada directamente de cima (90 º) para dar suporte para a réplica. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg.
- Recuperação de réplicas
- Após a conclusão do sombreamento replicação e estabilização de carbono, desligar a bomba de vácuo, ventilação da câmara, e remover o modelo de montagem do instrumento.
- Usando um par de fórceps grade fina remover cada stub espécime de ouro da duplaréplica folheto / braçadeira e permitir a descongelar durante vários segundos antes de baixar suavemente o topo sobre uma superfície de água, em uma placa de mancha (Figura 7). NOTA: A réplica de carbono / platina contendo material de amostra aderente irá flutuar sobre a superfície da água.
- Manobra as réplicas usando um laço de arame fino ou uma grade microscópio eletrônico de cobre convencional realizada por uma pinça de grão fino e transferência para outra placa de ponto contendo dicromato de sódio a 5% em ácido sulfúrico a 50% para uma a várias horas. NOTA: Este banho digere o material de amostra biológica real da réplica. Intensidade total de lixívia doméstica pode ser substituído por uma solução de ácido dicromato / ácido sulfúrico.
- Quando a digestão é completa, transferir a réplica de volta para a superfície da água limpa e recuperar dentro de uma grade de microscopia eletrônica de cobre padrão. (NOTA: Réplicas podem fragmentar em pedaços menores durante a digestão, mas mesmo muito pequenas réplicas podem conter informação substancial e deve ser retquistada e examinados.) réplica da loja apoiando grades em caixas de grade disponíveis comercialmente onde permanecerão estáveis durante anos com manipulação suave.
4 O exame ultra-de criofratura / Replicas de corrosão
- Ver réplicas em um microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de aceleração normalmente 50-80 kV.
- Grave imagens relevantes em filme TEM padrão ou com uma câmera digital de alta resolução.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A premissa fundamental de interpretação da imagem criofratura é que planos de fratura atravessar a bicamada lipídica das membranas que conferem duas faces da fratura, chamado por convenção a PF-face (plasma fratura-face) e EF-face (extracelular fratura-face) (Figura 3). O PF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao citoplasma da célula e o EF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao meio extracelular. A técnica de congelação-fractura é particularmente útil para a investigação da estrutura da membrana e as duas faces são tipicamente distintamente diferente com PF-faces sendo preenchida com muitas partículas de membrana associadas em contraste com EF-faces que contêm menos. Os conteúdos citoplasmáticos de células fracturada por congelação são tipicamente grossa na aparência e não são particularmente revelando embora organelos ligados à membrana, tais como núcleos de Golgi e pode ser facilmente identificado. De particular interesse para a investigators usando esta técnica são especializações da estrutura da membrana que podem ser interpretados para a sua função. Estes incluem distribuições específicas de membrana associada partículas, especializações de membrana ciliares e junções intercelulares.
Estruturas associadas ao Cilia
Residente na membrana da célula na base de cada um cílio eucariótica e flagelo é uma matriz de membrana associada partículas organizadas em fios que rodeiam o eixo dos cílios e conhecido como o colar ciliar (Figura 8) 12-16. Esta estrutura apresenta algum grau de heterogeneidade morfológica em várias espécies e tem-se especulado que ser multifuncional, na medida em que aparece antes do surgimento do eixo ciliar durante ciliogênese e permanece no local no cílio madura. O colar ciliar nascente deriva da agregação e organização de matrizes de partículas de membrana antes da hora do emergence do eixo ciliar durante ciliogênese sugerindo sua possível participação na organização inicial do axonema desenvolvimento 14.
Junções apertadas e epitelial permea lidade
Em vários tipos de epitélio, estudos criofratura revelar uma organização sofisticada de anastomose vertente e groove estruturas que circundam o aspecto apical das fronteiras basolateral. Esta estrutura de cinta, como é conhecido como a junção estanque ou zonulaoccludens (Figura 9) e acredita-se actuar como um regulador da permeabilidade epitelial para o fluxo paracelular 3, 17-20. Junções apertadas com alguns fios têm sido descritas como "vazamento", enquanto aqueles com mais organização complexa são descritos como "apertado". Esta organização parece ajustar-se a função do epitélio ao qual estão associados. A PF-faces de junções apertadas aparecem como fios enquanto a FE-faces exposição complemeranhuras ntary.
Junções Gap e comunicação intercelular
Junções comunicantes (Figura 10) aparecem em preparações criofratura de uma variedade de tecidos e são representados por matrizes densas de partículas na PF-faces e poços complementares sobre EF-rostos. Estas estruturas são pensadas para representar locais de membrana que facilitam a comunicação intercelular. Nos tecidos em que estão presentes, as manifestações da passagem de baixo peso molecular, corantes fluorescentes e fluxos de cálcio têm sido demonstradas 21-24, sugerindo que eles representam uma via física para a passagem de moléculas sinalizadoras.
Figura 1 Esquema de um criofratura planta / etch comercial. Na extrema esquerda é um pressurizado Dewar feeding de arrefecimento de azoto líquido para a fase de arrefecimento e espécime braço micrótomo sob condições controladas. No centro, a unidade com a câmara de amostra e de controlo electrónico painéis à direita. À direita é um tanque de azoto líquido adicional no qual o gás de exaustão é usado para trazer a câmara de amostra para a atmosfera.
Figura 2 Freeze-fratura / planta etch câmara espécime com a porta aberta para revelar posições de canhões de elétrons direcionalmente destinadas, cobertura de resfriamento, e amostras de postar onde amostras em suportes de metal são posicionados. Amostras são introduzidas para a câmara através de uma porta à esquerda do da câmara.
"width =" ig6highres.jpg 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Figura 4 Dois tipos de montagens de amostras para criofratura / procedimentos de corrosão. (Esquerda) Uma réplica espécime titular folheto duplo é usado para procedimentos criofratura convencionais realizados sem condicionamento. A amostra é colocada entre duas amostras topos de ouro e posicionado no livreto de bronze. A amostra é fracturada pela abertura do folheto sob vácuo na câmara de amostra (Ver congelar-fract ure_movie1.mov). (Direita) A montagem usado principalmente para congelamento e corrosão. A amostra é colocada sobre os topos de ouro e bloqueado no suporte de bronze. O espécime é fraturado por barbear suave com uma lâmina fixa no braço micrótomo. Esta configuração é o preferido para os procedimentos de gravura (Veja congelar-etch_movie2.mov). 
Figura 5 Preparação de uma amostra de criofratura montagem. A amostra é imprensado entre dois montes de ouro (a) e congelado em nitrogênio líquido a bem contendo propano (em primeiro plano), com posterior transferência para uma exploração Dewar contendo nitrogênio líquido (fundo), arrefecida ( B).
Figura 6 Demonstração de posicionamento de Frozen espécime criofratura no duplo réplica espécime titular folheto em preparação para a introdução para a câmara de amostra do / planta etch criofratura. 
Figura 7 Recuperação de réplicas seguintes fratura e sombreamento no / planta etch criofratura. "A" é uma superfície de água limpa em uma placa de ponto. A réplica flutuado a partir do topo da amostra é transferida para "B" uma cavidade contendo uma solução acidificada de dicromato de sódio ou de força total de lixívia doméstica para a digestão do tecido a partir da réplica. "C" representa superfícies posteriores água limpa para que a réplica limpa é transferido antes de being recuperadas dentro de uma grade microscopia electrónica de cobre. 
Figura 8 Cilia estruturas relacionadas reveladas por criofratura. Setas brancas apontam para matrizes de partículas membrana especializadas na fronteira luminal das células epiteliais em ciliogênese. Estas matrizes de partículas representam colares ciliares nascentes que residem nas bases dos cílios emergentes e maduros (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 9 Fractura através de membranas de células epiteliais revelar ing exemplos de PF- e rostos EF-fratura. A organização vertente e groove de complexos juncionais apertados é evidente eo espaço intercelular é marcado por setas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 10 A imagem de congelamento e fratura de uma junção de lacuna no fígado de rato. Partículas são evidentes na PF-face e poços complementares são evidentes na face EF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 imuno-localização de uma conexina usando um ouro coloidal anticorpo marcado em uma preparação criofratura ilustrando localização específica na junção gap. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 12 Um exemplo de congelação rápida com profunda gravura e sombreamento rotativo. Célula epitelial foi fraturado através do citoplasma e um PF-face é evidente (setas). Por trás das pontas de seta pode ser visto de uma superfície celular verdadeiro revelado por ataque subsequente. favor click aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 13 Um exemplo de congelação rápida com profunda gravura e sombreamento rotativo para revelar complexos moleculares contendo um ciliaryaxoneme traqueal bovina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nos anos seguintes a sua introdução e disponibilidade comercial, congelar-fratura / procedimentos de corrosão foram amplamente utilizado em investigações da estrutura da membrana biológica. Na verdade, as melhores perspectivas de algumas das especializações estruturais das membranas foram obtidos em preparações criofratura / etch. Estes estudos não só contribuiu para a compreensão da organização estrutural das membranas mas também forneceu insights sobre como a estrutura ea função estão relacionados.
O advento da microscopia eletrônica biológica rotina trouxe a consciência de que tratamentos químicos com os fixadores aldeídos, produtos químicos reativos e metais pesados necessários para conferir densidade eletrônica diferencial para amostras biológicas se contribuiu para a geração de artefato. O desenvolvimento da tecnologia de congelação-fractura foi baseado, em parte, um esforço para reduzir o processamento artefato. No entanto, tem sido reconhecido que criofratura/ Etch introduz seu próprio conjunto de artefatos, uma das mais importantes dos quais é o dano de cristais de gelo. Os tecidos directamente mergulhado em azoto líquido experiência uma velocidade de arrefecimento reduzida devido à formação de uma camada isolante de gás de azoto em torno do espécime, que resulta na formação de cristais de gelo que obliterar pormenor ultra-estrutural. Este problema é resolvido com a utilização de agentes crioprotectores, tais como glicerol e congelando o tecido em primeiro lugar na propano arrefecido em azoto líquido. Historicamente, mergulhar congelamento foi realizado em nitrogênio líquido refrigerado clorofluorcarbonos mas estes materiais foram retirados de uso, devido aos seus efeitos negativos sobre o meio ambiente. Mesmo nas melhores condições crioprotectores, a natureza do processo, resulta inevitavelmente num grosseira, como a superfície de cascalho em fracturas citoplasmáticos; No entanto, por meio de estruturas membranares fracturas revelam características bem organizados tendo organizações planares específicas em relação à sua orientação na membrana da célula. Estas imagens sãopossível apenas com a utilização de agentes crioprotectores, tais como o glicerol, que limitam os danos de cristais de gelo, e se o glicerol, em alguns casos, também podem introduzir um artefacto redistribuição de partículas associadas à membrana. Além disso, o glicerol não pode ser sublimada a partir da superfície fracturada limitando assim a oportunidade para a decapagem de sucesso. Se o procedimento de gravação subsequente é desejável, então, o espécime tem de ser rapidamente congelada em uma forma que limita os danos de cristais de gelo usando hélio líquido ou azoto lama e / ou abordado pela utilização de um agente crioprotector tal como acetona, que é rapidamente sublimada de fractura superfícies.
Embora o relatório inicial do boi estava focada em imagiologia vírus, é na estrutura da membrana que congelar-fratura / etch encontrado mais ampla aplicação. De fato, as estruturas, tais como junções apertadas e gap e especializações de membrana ciliar foram elegantemente revelado nas preparações criofratura. Freeze-fratura tem encd utilidade considerável na obtenção de um entendimento de diferenciação durante o desenvolvimento da membrana 15, 17,24 e na patologia da membrana 25-30. Os relatórios anteriores deste laboratório, demonstraram o padrão de diferenciação dos complexos juncionais apertados durante o desenvolvimento das vias aéreas, o rompimento de estruturas de membrana ciliar associados com a exposição agente infeccioso experimental e degradação dos complexos juncionais apertados nas células epiteliais das vias aéreas associadas a poluentes do ar e exposição à fumaça do tabaco em animais de laboratório e seres humanos.
Extensões técnicos do Freeze-Fratura / Freeze-etch Procedimento
O método de têmpera usando propano liquefeito para congelar as amostras aqui descritas é, talvez, o método mais comum para congelamento de amostras biológicas para-fractura por congelação convencional. No entanto, outras abordagens para a congelação deve ser apropriado onde freeze-etching deve ser realizared. Desde glicerol é um não-etchablecryoprotectant, as amostras para congelamento e corrosão devem ser congelados de modo a limitar a formação de cristais de gelo. Isto pode ser conseguido utilizando uma etchablecryoprotectant, tais como acetona e / ou por congelação da amostra de montagem contra uma superfície metálica arrefecida com hélio líquido ou lama de azoto líquido. Congelação rápida, sem crioprotectores, também pode ser realizada utilizando o congelamento por pulverização de alta pressão ou congelamento em propano liquefeito.
Os recentes esforços para relacionar ainda mais a estrutura e função usando a tecnologia freeze-fracture se apropriaram desta técnica em conjunto com imunohistoquímica 31, 32. Aqui, os anticorpos para antigénios específicos podem ser eficaz e precisa localizada para sítios da membrana (Figura 11).
Enquanto criofratura com sombreamento unidirecional é, de longe, o protocolo mais utilizado, alguns projetos experimentais chamará para congelação rápida com pouce ou crioproteção limitada, acompanhada por decapagem da superfície fracturada para revelar as superfícies verdadeiras células, matriz extracelular, e / ou complexos macromoleculares e sombreamento rotativo para transmitir contraste 16 (Figura 12 e Figura 13).
Há um crescente interesse em aplicações de congelamento e fratura em nanotecnologia, ciência dos materiais e na utilização desta técnica como uma ferramenta de imagem em biologia molecular. Na verdade, os nanomateriais, em muitos aspectos pode ser consistente em suas organizações com estruturas virais para as quais criofratura foi originalmente concebido como um meio de geração de imagens. Além disso, os lipossomas fabricadas, estruturas semelhantes na forma de membranas biológicas, estão sendo amplamente estudada para entrega alvo de agentes farmacêuticos e terapia genética dirigida. Devido a sua organização é essencialmente membrana como, processamento de fractura por congelação pode ter utilidade considerável na produção de imagens que revelam como um componente em desenpingar essas terapias 33.
Em resumo, as tecnologias de congelação-fractura ter sido de importância histórica na caracterização da organização e função das membranas celulares. No entanto, criofratura é encontrar novas áreas de utilidade, em coordenação com a biologia molecular e nanotecnologia e quase certamente irá contribuir para avanços nestas áreas em rápida expansão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
