Fundamental Teknisk Elements of Freeze-brudd / Freeze-etch i biologisk Elektronmikroskopi

Summary

Grunnleggende teknikker og avgrensninger av fryse-brudd behandling av biologiske prøver og nanomaterialer for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi er beskrevet. Denne teknikken er en foretrukket metode for å avsløre ultra funksjoner og spesialiseringer av biologiske membraner og for å få ultrastructural nivå dimensjonale og geodata i materialer fag og nanoteknologi produkter.

Abstract

Fryse-fraktur / fryse-etch beskriver en prosess der prøvene, typisk biologisk eller nanomateriale i naturen, er frosset, brukket, og gjenskapt for å generere en karbon / platinum "kastet" beregnet for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi. Prøver som er utsatt for frysing ultrarapid priser, ofte i nærvær av cryobeskyttelsesmidler å begrense iskrystalldannelse, med etterfølgende oppsprekking av prøven i flytende nitrogen avkjølt temperatur under høyvakuum. Den resulterende bruddflate replikeres og stabilisert ved fordampning av karbon og platina fra en vinkel som confers overflate tredimensjonal detalj til gipsen. Denne teknikken har vist seg særlig opplysende for etterforskningen av cellemembraner og deres spesialiseringer og har bidratt vesentlig til forståelsen av celleform til relatert celle funksjon. I denne rapporten kartlegger vi de krav instrument og teknisk protokoll for å utførefryse-brudd, den tilhørende nomenklatur og karakteristikker av sprekkeplan, variasjoner på den konvensjonelle prosedyren, og kriterier for tolkning av fryse-fraktur bilder. Denne teknikken har blitt mye brukt for ultrastructural etterforskning i mange områder av cellebiologi og holder løftet som en ny avbildningsteknikk for molekylær, nanoteknologi og materialer realfag.

Introduction

Konseptet og praktisk anvendelse av fryse-brudd bearbeiding av biologiske prøver ble innført av Steere ¹ over et halvt århundre siden. Den tidlige apparat bevilget ulike komponenter til en fungerende selvstendig enhet ^en. Den opprinnelige apparat ble modifisert og raffinert til kommersielt tilgjengelige instrumenter for å få plass til det kritiske behov for fjernmanipulering, opprettholdelse av høy-vakuum, og fordampning av karbon og metaller til å produsere en kopi egnet for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi (figur 1 og figur 2).

Den typiske instrument består av et høyt vakuumkammer med prøvebord og mikrotomen arm har regulerbar gjennomstrømning flytende nitrogen (figur 1). Kammeret inneholder også to elektronkanoner, en for å stabilisere karbon fordampning plassert i en 90 ° vinkel i forhold til prøvetrinn, og den andre for platinum / carbon skygging på en justerbar vinkel, typisk 15 º – 45 º (figur 2). Strømmen til den enhet brukes til å drive vakuumpumpen og elektroniske paneler regulere temperaturregulering og elektronkanon-styring.

Opprinnelig tenkt som et middel for å oppnå forbedret avbildning av virus, fryse-brudd fikk enda mer popularitet som en teknikk for undersøkelse og analyse av cellemembraner og deres spesialiseringer ^{2, 3.} Faktisk har denne prosedyren blitt integrert belyse struktur / funksjon relasjoner i celler og vev og mange av disse studiene stå som klassiske bidrag til celle-og molekylærbiologi ^4-9. Den store mål og begrunnelsen for utviklingen av fryse-brudd teknikken var å begrense gjenstander observer ved elektronmikroskopi oppløsning som stammer fra kjemisk fiksering og behandling brukt i konvensjonell biologisk elektronmikroskopi. Her er målet å begrense kjemiskfiksering og for å fryse prøven med tilstrekkelig hastighet, og ofte i nærvær av et kryobeskyttende middel for å begrense iskrystalldannelse og andre frysing gjenstander. Mer nylig har denne teknikken funnet en fornyet interesse fra molekylærbiologer og materialvitenskap etterforskere for undersøkelse av nanopartikler og nanomaterialer.

Fryse-brudd og fryse-ets bilder utviser en tredimensjonal karakter og noen ganger er tatt for scanning elektronmikro. Imidlertid er fryse-fraktur preparater undersøkt ved transmisjonselektronmikroskopi, og er deres store bidrag til høy oppløsning morfologiske studier deres unike representasjon av struktur / funksjonselementer av cellemembraner. Fryse-fraktur behandlingen initieres ved frysing celler og vev med tilstrekkelig hastighet til å begrense is krystallisering og / eller ved anvendelse av kryobeskyttende midler så som glycerol. Prøvestykkene blir deretter brukket under vakuum, og et replica genereres ved fordampning av karbon og platina over bruddflate. Den opprinnelige prøven er fordøyd fra replika som er hentet inn på en standard EM prøven rutenett. En annen vanlig feiltolkning av fryse-brudd bildene er at de skildrer celleoverflater. Imidlertid den grunnleggende forutsetningen for fryse-fraktur er at biologiske membraner er splittet gjennom den lipide dobbeltlags ved bruddprosessen (figur 3). Denne prosessen i biologiske membraner gir to bruddflater, en som viser organiseringen av den halve av membranen tilstøtende til cytoplasma, PF-ansikt, og en som viser halvparten av den bimolekylære paknings av membranen som er tilstøtende til det ekstracellulære miljøet, EF-ansikt. Sanne celleoverflater, er ikke representert i fryse-fraktur-bilder, men kun når den etterfølgende tilsatt trinnet med fryse etsing etter at brudd prosedyre benyttes. For å effektivt etse tidligere oppsprukne prøver å avsløre overflate detail, må prøvene fryses i et hurtig tempo og uten unetchablecryoprotectant. Etsing av vann fra overflaten av de frakturerte prøven avdekker underliggende funksjoner oppnås ved å plassere kjøle mikrotomen arm over prøvetrinn opprette en temperaturdifferanse mellom den fasen som holder prøven og kjøle mikrotomen arm som fører vann til å sublimere fra overflaten. Når vann blir sublimert fra overflaten av de frakturerte prøven under fryse-etsing manøver, deretter aspekter av selve celleoverflater, ekstracellulær matrise, cytoskeletal strukturer, og molekylære sammenstillinger kan være avdekket med høy oppløsning. Dermed fryse-brudd og fryse-etch er ikke utskiftbare vilkår, men heller reflektere en trinnvis prosess sistnevnte som ikke kan være nødvendig eller ønskelig, avhengig av behovene til den aktuelle studien.

Etter fryse-fraktur / fryse-etsefremgangsmåter, er de oppsprukne overflater underkastet rettet fordamperentiv strøk av karbon og platina, for å gi støtte og avbildnings kontrast til replika. Den platina / karbon avbildning fordampning kan være ensrettet eller roterende, og blir oppnådd ved enten resistens eller elektronkanoner. Enveis skygging fra en kjent vinkel, typisk 30 º – 45 º, er nyttig i å utføre visse morfometriske beregninger. Prøver som har vært utsatt for dyp-etsning er typisk roterende skygget, og de resulterende bilder av disse prøvene er fotografisk reverseres for evaluering.

Den historiske samt en liggende mål i fryse-fraktur / fryse-ets-teknikk er å begrense kjemisk fiksering og prosessering prøve gjenstander som er forbundet med flere konvensjonelle transmisjonselektronmikroskopi prosedyrer. Imidlertid gir denne teknikken en saklig fordel i sin evne til å gi tredimensjonale detaljer og dermed legge til rette for kjøp av morfometriske data i biologiske, materialvitenskap, og nanotechnology prøver. Fryse-brudd og fryse-ets prosedyrer er komplekse og mangefasettert, og noen aspekter av sin søknad er tilpasset. Denne presentasjonen gir en undersøkelse utsikt over de viktigste funksjonene i prosessen og leseren er henvist til omfattende publiserte protokoller ^{10, 11} for å ta opp detaljene og tilpasse prosessen for spesifikke forskningsbehov.

Protocol

1. Utarbeidelse av biologiske prøver for Freeze-brudd / Freeze-etch Bruk en konvensjonell EM fiksativ formulering slik som 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer i 1 time. for å utføre primær fiksering av biologiske vev. MERK: Selv om det kan være ønskelig å fryse enkelte typer prøver uten forutgående fiksering, universal blodbårne patogener forholdsregler påbyr hensiktsmessig fiksering hvor prøven består av humant vev. Etter primær fiksering, skylling prøven i den…

Representative Results

Nøkkelen forutsetningen for fryse-brudd image tolkning er at brudd flyene passere gjennom lipidbilag av membraner overdragelse to frakturoverflater, kalt av konvensjonen PF-ansikt (plasma brudd-ansikt) og EF-ansikt (ekstracellulære brudd-ansikt) (figur 3). Den PF-ansikt er halvparten av membranens lipidbilag som grenser til cytoplasma av cellen og EF-ansikt er halvparten av membranens lipidbilag som grenser til det ekstracellulære miljø. Fryse-brudd teknikken er spesielt nyttig for etterforskningen …

Discussion

I årene etter introduksjonen og kommersiell tilgjengelighet, fryse-brudd / Etch prosedyrer ble mye benyttet for undersøkelser av biologisk membran struktur. Faktisk har de beste perspektiver av noen av de strukturelle spesialiseringer av membraner er innhentet i fryse-brudd / Etch forberedelser. Disse studiene ikke bare bidratt til forståelse av den strukturelle organiseringen av membraner, men også gitt innsikt i hvordan struktur og funksjon er i slekt.

Ankomsten av rutine biologisk ele…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.