פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
כמה מינים של חיידקים בעלי היכולת לצרף למשטחים וליישב אותם בצורה של סרטים דקים שמכסים. Biofilms שגדלים בתווך נקבובי רלוונטי לכמה תהליכים תעשייתיים וסביבתיים כגון טיפול בשפכים וCO 2 קיבוע. אנחנו השתמשנו Pseudomonas fluorescens, חיידק אירובי גראם שלילית, לחקור היווצרות biofilm במכשיר microfluidic שמחק תווך נקבובי. מכשיר microfluidic מורכב ממערך של מיקרו הודעות, שהיו מפוברקים באמצעות רכה ליתוגרפיה. בהמשך לכך, היווצרות biofilm במכשירים אלה עם זרימה נחקרה ואנחנו מדגימים את היווצרות biofilms הסיבי הידוע בסרטים במכשיר שלנו. הפרוטוקולים מפורטים לייצור והרכבה של מכשיר microfluidic מסופקים כאן יחד עם פרוטוקולי תרבות החיידקים. נהלים מפורטים לניסויים עם מכשיר microfluidic גם מוצגים יחד עם נציגתוצאות.
Introduction
לאחרונה, הפגנו דינמיקת היווצרות biofilm חיידקים במכשיר microfluidic המחקה תווך נקבובי 1. biofilms חיידקים הם למעשה מושבות של חיידקי משטח מצטבר שנארזות על ידי חומרים תאיים פולימרים (EPS) 2-4. סרטים דקים אלה של חיידקים יכולים להיווצר כמעט בכל נישה אפשרית, החל ממשטחים חלקים לגידול הרבה יותר מורכב של תווך נקבובי. Valiei et al. 1 משמש מכשיר microfluidic עם מערך של מיקרו עמודים כדי לדמות מבנה תווך נקבובי ולמד היווצרות biofilm במכשיר זה כפונקציה של קצב זרימת נוזל. הם מצאו כי בזרימה משטר מסוים, biofilms הסיבי הידוע בסרטים החל לצוץ בין עמודים שונים. יכולים להיות קשורים סרטים באחד או בשני קצוות למשטחים מוצקים, אבל שאר המבנה מושעה בנוזל. היווצרות Streamer בדרך כלל מתחילה לאחר שכבה ראשונית של biofilm יצרה והפורמט שלהיון יכול להכתיב את ההתפתחות ארוכת הטווח של biofilm בבתי גידול מורכב כאלה. לאחרונה, מספר חוקרים חקרו את הדינמיקה של היווצרות נחלים. יזדי et al. 5 הראה כי הסרטים יכולים להיווצר בתזרים טרנדו שמקורם בבועת נדנוד. בניסוי אחר, רוסקוני et al. 6 חקר את ההשפעה של עקמומיות ערוץ וגיאומטריה ערוץ על ההיווצרות של סרטים. הם מצאו כי הסרטים יכולים ליצור בסעיפים מעוגלים של microchannels, ומורפולוגיה נחלים קשורה לתנועתיות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי סרטים יכולים להיות לו השלכות רחבות בתרחישים טבעיים ומלאכותיים שונים כפי שהם יכולים לפעול כמבשרים להיווצרות של מבנים בוגרים בממשקים נקבוביים, יובילו להתפשטות biofilm מהירה והרה אסון במערכות ביו, וגם לגרום לflow- המשמעותי אינטראקציות מבנה, וכו '1,7-9.
לעתים קרובות סרטי biofilm טופס Iבתי גידול n מורכבים כגון תווך נקבובי. צמיחת biofilm הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית היא רלוונטית למספר תהליכים סביבתיים ותעשייתיים כגון טיפול ביולוגי בשפכים 10, שמירה גם נשא שלמות במצבים כגון CO 2 ללכוד 11 וחיבור של הנקבוביות באדמה 12. התבוננות היווצרות biofilm בבתי גידול מורכב כזה יכול לעתים קרובות להיות מאתגרת בשל האטימות של תווך נקבובי. במצבים כאלה, פלטפורמות תווך נקבוביות מיקרופלואידיקה מבוססת יכולות להוכיח יתרון מאוד מאחר שהם מאפשרים בזמן אמת ובניטור באתר. יתרון נוסף של מיקרופלואידיקה הוא היכולת לבנות bioreactors מרובה בפלטפורמה יו-microfluidic אחת ובו זמנית לאפשר לניטור ו / או שילוב של חיישנים מקוונים. הגמישות ליישם ניסויי מעבדה מרובים במכשיר אחד ואת היכולת לאסוף נתונים רלוונטיים משמעותיים לניתוח סטטיסטי מדויק היא עו"ד חשובantage של מערכות microfluidic 13,14.
בהקשר של הדיון לעיל, דינמיקת היווצרות נחלים הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית תהיה מועילה למספר יישומים. במחקר זה, אנו מפתחים פרוטוקול לחקירת היווצרות נחלים במכשיר שתווך נקבובי מחקה. ייצור של פלטפורמת microfluidic, צעדים דרושים לתרבית תאים וניסויים מתוארים. בניסויים שלנו, זן חיידקים מהסוג בר של fluorescens Pseudomonas הועסק. פ fluorescens, נמצא באופן טבעי באדמה, ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על האקולוגיה קרקע 15. זן החיידקים המועסקים היה מהונדס גנטי כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) constitutively.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו הפגנו מכשיר microfluidic פשוט המחקה תווך נקבובי ללימוד פיתוח biofilm בבתי גידול מורכב. יש כמה שלבים קריטיים המכתיבים את תוצאות הניסויים. הם כוללים גיאומטריה מכשיר. בעוד בהודעה הגיאומטריה יכולה להשתנות, נקבובי המרחב מספיק לסרטים כדי ליצור יש צורך. יתר על כן, Valiei et al. <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. . Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
