마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
몇몇 세균 종은 표면에 부착 생물막 불리는 박막의 형태로 이들을 정착 할 수있는 능력을 갖는다. 다공성 매체에서 성장 바이오 필름은 폐수 처리 및 CO 2 격리 등의 여러 산업 및 환경 프로세스에 적합하다. 우리는 모방 다공성 지지체를 미세 유체 장치에서 biofilm 형성을 조사하기 위해, 슈도모나스 fluorescens 그람 음성 호기성 세균을 사용했다. 미세 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 제조 된 마이크로 게시물의 배열로 구성되어 있습니다. 그 후, 흐름이 장치에서 biofilm 형성을 조사하고, 우리는 우리의 장치 깃발로 알려진 사상 바이오 필름의 형성을 보여줍니다. 제조 및 미세 유체 장치의 조립을위한 상세한 프로토콜은 세균 배양 프로토콜과 함께 여기에 제공됩니다. 마이크로 유체 장치와 실험에 대한 자세한 절차는 담당자와 함께 제공됩니다결과.
Introduction
최근에, 우리는 다공질 일을 모방 한 미세 유체 장치에서 세균 biofilm 형성의 역 동성을 보여 주었다. 세균 바이오 필름은 기본적으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 2-4으로 쌌다 아르 표면 집계 박테리아의 식민지입니다. 세균이 박막은 부드러운 표면을 다공성 매체의 훨씬 더 복잡 서식지에 이르기까지 거의 모든 생각할 수있는 틈새 시장이 형성 될 수 있기 때문이다. Valiei 외. 1 다공질 구조를 시뮬레이션하기 위해 마이크로 – 기둥 배열을 미세 유체 소자를 사용 및 액체 유량의 함수로서이 장치에서 바이오 필름 형성을 연구 하였다. 그들은 특정 흐름 정권, 깃발로 알려진 사상 바이오 필름은 다른 기둥 사이에 등장하기 시작 것을 발견했다. 깃발에 닿는 일 수 있거나 둘 고체 표면에 끝나지만 구조의 나머지는 액체 중에 현탁된다. 보리 형성은 일반적으로 시작하는 바이오 필름의 초기 층 형성과 그 형식 후이온은 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 장기적인 발전을 지시 할 수 있습니다. 최근 여러 연구자들은 유영 형성의 역학을 조사 하였다. 야 즈디 등. 5는 깃발이 진동 거품에서 발생하는 와류 흐름에 형성 할 수있는 것으로 나타났다. 또 다른 실험에서, Rusconi가 외. 6 깃발의 형성에 채널 곡률 및 채널 형상의 효과를 조사 하였다. 그들은 깃발이 마이크로의 굴곡 부분에 형성 할 수있는 것을 발견하고, 유영 형태는 운동과 관련이있다. 최근의 연구에 깃발들이 다공성 인터페이스에서 성숙 구조의 형성에 선구자 역할을 할 수 있습니다로, 다양한 자연과 인공 시나리오에서 폭 넓은 영향을 생물 의학 시스템에서 신속하고 치명적인 바이오 필름의 증식으로 이어질, 또한 상당한 플로우 기반을 일으킬 수 있다는 것을 보여 주었다 구조의 상호 작용 등 1,7-9.
바이오 필름의 깃발은 자주를 형성다공성 매체와 같은 N 복잡한 서식지. 다공성 미디어 환경의 이해 생물막 성장은 같은 CO 2 포집 11로 상황에서 잘 보어의 무결성을 유지하고 토양 12 모공의 막힘 생물학적 폐수 처리 (10)로 여러 가지 환경 및 산업 공정에 관련이있다. 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 형성을 관찰하는 것은 종종 의한 다공질의 불투명도에 도전 할 수 있습니다. 그들이 실시간 인 시츄 모니터링을 허용하는 이러한 상황에서, 마이크로 유체 기반 다공성 미디어 플랫폼은 매우 유리한 증명할 수있다. 마이크로 유체의 또 다른 장점은 단일 바이오 마이크로 유체 플랫폼에서 여러 생물 반응기를 구축하고 동시에 온라인으로 모니터링 및 / 또는 센서의 통합을 허용하는 능력이다. 하나의 장치 및 정확한 통계적 분석을 위해 상당한 관련 데이터를 수집하는 기능이 여러 실험실 실험을 구현하는 유연성 중요하다 ADV미세 유체 시스템 (13, 14)의 ANTAGE.
위 설명의 문맥에서, 다공성 매체 환경에서 이해 유영 형성 역학은 여러 응용에 유익 할 것이다. 본 연구에서는 본뜬 다공성 매체 장치에서 스 트리머 형성을 조사하는 프로토콜을 개발한다. 미세 유체 플랫폼의 제조는, 세포 배양과 실험에 필요한 단계가 설명되어 있습니다. 실험에서는, 슈도모나스 fluorescens의 야생형 균주 사용 하였다. P. 토양에서 자연적으로 fluorescens는 토양 생태 (15)을 유지에 중요한 역할을합니다. 사용 된 균주는 유전자 구성 적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 복잡한 서식지에서 바이오 필름 개발 연구를위한 다공성 미디어를 모방하는 간단한 미세 유체 장치를 보여 주었다. 실험의 결과를 지시 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그들은 장치의 형상을 포함한다. 포스트 형상은 다를 수 있지만, 깃발은 형성하기위한 적절한 기공 공간이 필요합니다. 더욱이 Valiei 외. 1 트리머 형성 할수 특정 유량 범위에서 발생 것을 증명했다. 임…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
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