Summary
Ce protocole décrit l'utilisation de réactions de couplage de l'amide d'acide isonicotinique et diaminoalcanes pour former ligands pontants appropriés pour une utilisation dans la synthèse de complexes de platine polynucléaires, qui combinent les aspects des médicaments anticancéreux et BBR3464 picoplatin.
Introduction
Médicaments anticancéreux platine demeurent l'une des familles les plus largement utilisés des agents dans le traitement du cancer humain 1. Malgré leur succès, ils sont limités dans leur application par les graves effets secondaires limitant la dose 2-4. Les doses limitées qui peuvent être administrées à des patients signifie aussi que les tumeurs peuvent développer une résistance 5. Ainsi, les nouveaux médicaments continuent d'être mis au point pour améliorer le profil d'effets secondaires et de surmonter la résistance acquise, comme phenanthriplatin 6 et 7 phosphaplatin.
À la fin des années 1990, un médicament tricycliques de platine a été développé, BBR3464 (schéma 1) 8, qui est jusqu'à 1000 x plus cytotoxique in vitro que le médicament de platine de premier plan, le cisplatine. BBR3464 est également en mesure de surmonter la résistance acquise à un panel de lignées de cellules cancéreuses humaines 9. Malheureusement, l'augmentation de l'activité de BBR3464 est compensée par 50 - 100 - fois plus toxique, quilimite son utilisation 10-12. Il est également facilement dégradés dans l'organisme, ce qui signifie peu du médicament atteint d'un cancer des noyaux intacts 9.
Picoplatin est un médicament à base de platine mononucléaires qui contient un ligand (schéma 1) 13 2-méthyl-pyridine. Le groupe méthyle de ce médicament, la protège contre l'attaque par des nucléophiles biologiques; en particulier la cystéine et la méthionine contenant des peptides / protéines 14-16. En tant que tel, le médicament est très stable et a une concentration beaucoup plus élevée que les noyaux atteint du cancer par rapport à la fois avec le cisplatine et BBR3464 17. Sa réactivité réduite signifie aussi picoplatin a une dose maximale tolérée supérieur par rapport à BBR3464 et cisplatine 10,18,19.
Ce projet a donc cherché à combiner les propriétés de BBR3464 et picoplatin à produire de nouveaux médicaments qui sont en mesure de surmonter la résistance acquise à afficher une meilleure stabilité biologique et moins sévère côté-effects (par exemple, la figure 1). Pour ce faire, une série de complexes de platine dinucléaires ont été préparés avec des ligands pontants bispyridine 20. Les ligands sont réalisées en utilisant des réactions de couplage d'amide avec de l'acide isonicotinique, ou ses dérivés tels que le 2-méthyl-isonicotinique, diaminoalcanes de longueur variable. Réaction d'un équivalent molaire des ligands avec deux équivalents molaires de transplatine, on obtient les complexes de platine désirés (Schéma 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Synthèse de la N, N '-. (Alcane-1, n-diyle) diisonicotinamide
- Sécher un seul cou ou ballon tricol à fond rond dans un four (100 ° C, 1 h) pour assurer toute l'humidité est éliminée.
- Ajouter de l'acide isonicotinique solide, ou son dérivé, dans le ballon le long d'un barreau d'agitation magnétique. Si le ligand (s) de diaminoalcane sont solides à la température ambiante, puis 0,5 mole (au nombre de moles de numéro de l'acide isonicotinique) est ajoutée à la fiole à ce stade.
- Boucher le col (s) du ballon avec des septa en caoutchouc et de remplacer l'air dans le flacon avec de l'azote soit par un courant continu d'azote ou par l'utilisation de ballons gonflés à l'azote.
- Utiliser une aiguille hypodermique et une seringue pour ajouter le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde anhydre (4 ml par 500 mg d'acide isonicotinique, l'acide 2-méthyl-isonicotinique) pour dissoudre le solide. Si les solides ne se dissolvent pas facilement, puis chauffer la solution doucement.
- Ajouter 7 équivalents molaires (à la unemontage de l'acide nicotinique utilisé) de triéthylamine (de base faible) et 0,5 équivalents molaires de la diaminoalcane. Si la solution est un liquide à température ambiante, puis ajouter 1,5 équivalents molaires.
- Ajouter un équivalent molaire de l'anhydride 1-propylphosphonique (agent de couplage) avec une agitation continue et permettre à la réaction pour terminer au-dessus de 5 à 12 hr.
2. Purification des ligands
- Pour bispyridine ligands faites en utilisant des ligands diaminoalcane avec 10 ou plusieurs groupes méthylène, attendre que les produits de la précipitation à partir de solution que la réaction progresse.
- Pour bispyridine faites en utilisant des ligands diaminooctane, précipiter le produit par addition de ~ 40 ml d'eau.
- Pour bispyridine diaminoalcanes faite en utilisant de deux à six groupes méthylène, ajouter ~ 40 ml d'eau et permet aux composés cristallisent au cours de 1-3 jours.
- Recueillir chaque ligand bispyridine par filtration sous vide et on recristallise à partir d'environ 400 à 500 ml d'eau bouillante par 200mg de ligand. Remarque: Plus l'eau est nécessaire pour les ligands plus bispyridine en raison de leur solubilité dans l'eau très réduite.
- Ajouter NaOH et KOH (pH 9) à la solution pour faire en sorte que les composés sont des bases libres lors de la recristallisation.
3. Synthèse et purification des dinucléaires Platinum Complexes
- Dissoudre complètement trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatine, dans (70-80 º C) de l'eau chaude (150 ml par 200 mg de transplatine) pour produire une solution de couleur jaune clair fortement.
- Ajouter un 0,5 équivalent molaire du ligand bispyridine et agiter la solution à la température jusqu'à dissolution du ligand (solution limpide). Attendez que la solution à tourner presque incolore, éteindre le feu, et agiter à température ambiante pendant quelques heures supplémentaires.
- Eliminer le solvant par evaporation rotative, ce qui va donner une poudre de couleur jaune.
- Purifier le complexe de platine (s) par dissolution dans une quantité minimale d'eau chaude (~ 50 &N ° 186, C). Si restants solides de couleur jaune ou blanche sont présents, puis filtrer ces off.
- Ajouter de l'acétone à la solution jusqu'à ce qu'un précipité blanc se forme, qui semble être une forme polymère de complexes métalliques et représente jusqu'à 10% du produit de réaction. Continuer à ajouter de l'acétone (~ 20-30 ml) supplémentaires jusqu'à ce que plus précipité apparaît. Remarque: ce précipité blanc est une impureté.
- Supprimer ce précipité par filtration le contenu à travers un papier filtre en nylon (0,2 um de taille de pore) et evaporation rotative de la solution restante à siccité, ce qui donnera un produit pur. Remarque: Si nécessaire, des mesures supplémentaires alors acétone de précipitations peuvent être effectuées jusqu'à ce que le complexe est pur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les ligands de bispyridine et leurs complexes de platine dinucléaires respectifs sont caractérisés par une H, 13 C et 195 Pt RMN (Tableaux 1 et 2), et la spectroscopie de masse à ionisation par électrospray. Les points de fusion précis peuvent être déterminés en utilisant la calorimétrie à balayage différentiel et la pureté est le mieux déterminé par analyse élémentaire pour C, H et N la teneur en pourcentage. De plus l'utilisation est de 1 H RMN car il est rapide et facile à utiliser, qui donne des résultats en quelques minutes de l'isolement des produits finaux avec des résonances qui peuvent définitivement démontrer succès couplage amide et de coordination du platine (tableaux 1 et 2).
L'acide nicotinique a trois résonances; deux doublets dans la région aromatique (7-9 ppm) et une très large résonance autour de 13 ppm pour le proton de l'acide carboxylique. Les résonances protoniques diaminoalcane sont tous situés dans la région aliphatique compris entre 1 et 4 ppm. Comme til longueur des diaminoalcane chaîne augmente beaucoup des résonances du méthylène devienne équivalent, et en tant que tels, moins de pics sont observés dans la région aliphatique que celle attendue; mais ils sont nettement plus intense et peuvent être affectées de manière lâche par leurs intégrations (Tableaux 1 et 2). Par exemple, voir les figures 1 et 2 pour la structure chimique et les spectres 1 H RMN du N, N '- (octane-1 ,8-diyle) bis (isonicotinamide), biao, ligand. En raison de la symétrie dans la molécule cinq résonances aliphatiques devraient normalement pour biao; mais les quatre pics les plus méthylène internes sont tous magnétiquement équivalent et apparaissent comme une grande résonance à ~ 1,2 ppm.
La résonance du proton de l'aminé de la chaîne de diaminoalcane désaccouplé est situé dans la région aliphatique et est la résonance la plus importante lors de son déplacement vers les champs faibles de façon significative, dans la région aromatique, lors de l'accouplement to l'acide carboxylique. La résonance du proton amide subséquente est considéré autour de 8,7 ppm pour l'ensemble de ces ligands, en tant que relativement large résonance triplet (Figure 2).
La coordination du groupe du platine aux ligands bispyridine est observé à travers des changements sélectifs des résonances aromatiques du ligand (0,15 ppm vers les champs faibles décalage des résonances Ha et 0,07 ppm à travers le terrain décalage des résonances Hb) et l'observation de couplage de platine sur la résonance du doublet pour l' protons Ha (Figure 3). Coordination des groupes de platine à ligand bispyridine peut également observer aisément en utilisant 195 Pt RMN. Le déplacement chimique de la résonance du platine est directement lié aux types d'atomes coordonnés 21. ligands Chlorido déplacent 195 résonances Pt downfield (vers 0 ppm) et je suis (m) ino ligands déplacent les résonances à travers le terrain (vers -2500 ppm). Les complexes de platine dinucléaires synthétisés ici montrent un seul r esonance autour de -2300 ppm en raison de la x h 3 (m) ino et 1 x état de coordination de chlorido (figure 4) 22. N'ayant pas réagi transplatine impureté montrerait comme une résonance autour de -2100 ppm alors que si deux ligands ont réagi avec une molécule unique de transplatine (4 x h (m) de l'environnement de ino) alors cette impureté serait à travers le terrain de -2400 ppm 22.
Schéma 1 Les structures chimiques des médicaments de platine et picoplatin BBR3464 et le schéma de synthèse général pour la synthèse des ligands de bispyridine et leurs complexes de platine dinucléaires respectifs.; R = H ou CH 3; . n = 1-6 ions compteur pour les complexes de platine ont été omis; en utilisant le procédé décrit ici, ils sont le dichlorure de sels.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Figure 1 La structure chimique de la N, N '-.. (Octane-1 ,8-diyle) bis (nicotinamide) ligand, Biao, et le système de numérotation de protons utilisé pour l'attribution des résonances dans la RMN 1 H Notez l'équivalence des quatre protons du méthylène (He) dans le centre de la molécule.
Figure 2 La RMN 1H (DMSO-D 6, 400 MHz) de N, N '-. (Octane-1 ,8-diyle) bis (nicotinamide), biao Notez l'emplacement de la résonance triplet amide à environ 8,7. ppm, jusqu'à 1-2 ppm pour la résonance diaminooctane amine avant le couplage.
Figure 3. L'RMN 1 H (D 2 O, 400 MHz), le spectre de trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl} 2 μ-biao] 2 +. Remarque Le couplage du platine sur la résonance Ha aromatique à 8,82 ppm.
Figure 4. L'Pt 195 RMN (D 2 O, 400 MHz), le spectre de trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl}. 2 μ Biao] 2 + Notez la large résonance unique autour de -2300 ppm qui est compatible avec un environnement PTN 3 Cl; N = h (m) ine.
Tableau 1 Les 1 H RMN des données de caractérisation des ligands bispyridine dans le DMSO-d 6 à 400 MHz d = doublet..; t = triplet; q = quartet; m = multiplet.
Tableau 2. RMN 1 H Les données de caractérisation des complexes de platine dinucléaires de D 2 </ Strong> O à 400 MHz d = doublet.; t = triplet; q = quartet; m = multiplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce travail, des complexes dinucléaires de platine ont été synthétisés comme agents anticancéreux potentiels. Ce faisant ligands de pontage bispyridine ont été synthétisés par une réaction de couplage de type amide en utilisant de l'acide isonicotinique et diaminoalcanes de longueur variable. Auparavant, la synthèse de bispyridine ligands et leurs analogues méthylés avec 2 à 8 groupes méthylène et de leurs complexes de platine respectifs ont été rapportés. Dans cet article, la méthode de synthèse et de purification a été révisé le rendant plus rapide et moins cher et ont démontré par la synthèse de ligands bispyridine avec 8, 10 et 12 groupes méthylène (le plus court avec les groupes méthylène huit, Biao, a été faite pour comparer la nouvelle Procédé de purification de la méthode plus ancienne). Complexes dinucléaires de platine ont également été faites en utilisant ces ligands.
La synthèse des ligands bispyridine a été achevé dans un solvant anhydre et sous atmosphère inerte d'azote à l'aide de la triéthylamine en tant que base faible etanhydride propylphosphonique comme agent de couplage. Soit le DMF ou le DMSO peuvent être utilisés comme solvant, bien que l'acide isonicotinique se dissout mieux dans le DMSO qu'elle ne le fait dans le DMF. Soit pour solvant, un chauffage doux sous un ruisseau d'eau chaude peut être utilisée pour faciliter la dissolution.
Cette méthode ancienne requis des durées prolongées de réaction (plusieurs jours) et un procédé de purification en plusieurs étapes comprenant une extraction liquide / liquide à l'encontre de l'éther diéthylique et neutralisation avec NaHCO 3, qui est maintenant éliminée. Les réactions de synthèse de ligands sont maintenant achevées en quelques heures à la température ambiante après que tous les réactifs sont ajoutés en même temps en une seule étape. Les ligands bispyridine précipitent à partir de la solution avec addition d'eau (pour des ligands avec 8 ou moins de groupes méthylène), et précipitent à partir de la solution lors de la formation pour les ligands du groupe 10 et 12 de méthylène. Tous les ligands peuvent être recristallisés à partir d'eau bouillante et dans certains cas, leur lente recrystalltion peut donner des cristaux appropriés pour la diffraction des rayons X.
Les complexes de platine dinucléaires sont préparés en faisant réagir deux moles d'transplatine pour une mole de ligands de bispyridine. L'effet trans-labializing des ligands chlorido garantit que le produit principal est la coordination des médicaments de platine grâce à un site unique sur les ligands (bispyridine l'atome d'azote du cycle). Les complexes de platine dinucléaires ont une bonne solubilité des sels dicationiques à la fois l'eau, le DMF et le DMSO.
La purification est effectuée par précipitation fractionnée avec de l'acétone. L'impureté non identifiée avant que le produit précipite et est éliminé par filtration à travers un papier filtre de pores étroite. Il est important de noter que la précipitation de l'acétone fonctionne mieux avec l'augmentation de la quantité de produit à purifier. À des montants inférieurs à 200 mg, la méthode ne fonctionne pas aussi bien et précipitations répétées de l'acétone peut être nécessaire. Pour les montants d'environ 200 mg ouplus nous avons constaté que des mesures simples acétone de précipitations ne sont généralement nécessaires.
Bien que ce document détaille la synthèse de ligands spécifiques et complexes de platine, les techniques utilisées ici peuvent être appliqués à la synthèse d'un éventail beaucoup plus large de ligands et complexes de platine polynucléaires. Par exemple, avec des groupes protecteurs appropriés d'autres ligands, tels que diaminoalcane la spermine et la spermidine, peuvent être utilisés pour fabriquer des ligands bispyridine. Bispyridine ligands non symétriques peuvent également être faites en utilisant de l'acide isonicotinique sur une extrémité et de 2-méthyl-isonicotinique à l'autre extrémité. Ces ligands non symétriques peuvent être générés par l'utilisation de FMOC / BOC-protection sur l'une des extrémités des chaînes de diaminoalcane. L'amine non protégée de la chaîne peut être mis à réagir avec un dérivé isonicotinique en utilisant les réactions de couplage d'amides décrits. Le groupe protecteur est ensuite clivé de la chaîne de diaminoalcane et d'un dérivé différent de l'acide isonicotinique est fixé au moyen d'unune autre réaction de couplage de type amide. Complexes de platine tricycliques peuvent aussi éventuellement être effectuées en utilisant l'un de ces ligands par l'intermédiaire d'une adaptation d'un procédé utilisant des ligands à base pyrazolyle-faire tricyclique, BBR3464-like, les complexes 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
