Introduction
Les virus entériques humains sont importants agents responsables de maladies d'origine hydrique 1-3, mais sont généralement présents en faible nombre dans les eaux environnementales contaminées, ce qui rend leur détection difficile sans concentration. Les procédures utilisées pour concentrer les virus comprennent généralement une étape de filtration, suivie d'une élution filtre et secondaire concentration de l'éluat de filtration. Une procédure de filtration commune se fonde sur l'utilisation de membranes chargées telles que des filtres électropositifs (récemment examinés dans 4,5). Ces filtres reposent sur la capture des virus en suspension dans l'eau en utilisant des interactions électrostatiques entre la surface de filtre (chargé positivement) et les particules virales ciblées (chargés négativement). Deux filtres électropositifs qui sont disponibles dans le commerce se appuient sur cette technologie, les filtres en verre / cellulose nano-alumine et / fibres de verre. Les coûts de filtrage verre / cellulose sont jusqu'à 10 fois celle de la / fibres de verre nano-alumine, ce qui limite l'utilisation du verre / cellulose filtres pour la surveillance du virus de routine. Des études récentes ont conclu différences sont nominales entre ces deux filtres dans la récupération des entérovirus de 6,7 de l'eau ambiante, ce qui justifie l'utilisation d'une alternative de filtre moins cher. Autres options de filtres tels que les filtres électronégatifs et de laine de verre ont été étudiés, cependant, ils nécessitent soit le prétraitement de l'eau de source (filtres électronégatifs) ou ne sont pas disponibles dans le commerce (filtres de laine de verre). L'élaboration de procédures de concentration de virus a surtout mis l'accent sur l'optimisation des techniques de concentration primaires (filtres) afin d'améliorer la récupération de virus de l'eau. Toutefois, les procédures de concentration secondaires, qui réduisent le volume d'éluant typiquement de 1 L à millilitre volumes, peuvent également avoir un impact significatif sur les recouvrements de virus 8.
Concentration secondaire des virus entériques repose généralement sur un agent de floculation tels que certains types de l'extrait de boeuf (floccu organiquement) ou le lait écrémé floculation 12/09 pour éliminer les particules virales à partir des surfaces de filtrage. Récemment, une autre procédure de concentration secondaire en utilisant l'extrait de boeuf couplé avec l'ajout de célite (particules fines) a montré des résultats prometteurs pour la récupération de l'adénovirus, entérovirus, norovirus et 8,13,14. Celite travaux de concentration en vertu des principes similaires à ceux du procédé de floculation organique en ce que des particules de virus se attachent et sont libérés à partir de particules (floculation ou la célite) en modifiant le pH de la solution de suspension. Les comparaisons entre ces deux techniques de concentration secondaires ont été évalués dans la récupération des adénovirus pointes (adv) types 40 et 41 8. Cette étude a conclu que les deux techniques de concentration secondaires étaient statistiquement similaires dans la récupération des adénovirus. Cependant, le procédé de floculation organique nécessite une 30 min. incubation à un pH de 3,5, tandis que la technique de célite nécessite une incubation plus court (10 min) à un pH de 4,0. Le flocculat organiqueion nécessite également l'utilisation d'équipement de laboratoire coûteux (des centrifugeuses) pour recueillir des particules de floc pendant concentration tertiaire, la technique de la celite en revanche ne utilise que des équipements de laboratoire de base (filtration sous vide) pour séparer les particules de la suspension de célite.
Certaines combinaisons de filtres et de techniques d'élution secondaires peuvent également affecter récupérations de virus. Une étude a conclu que certaines combinaisons de primaires (filtres électropositifs) et des techniques de concentration secondaires (célite ou floculation organique) ont eu un impact significatif de la reprise de l'adénovirus 13. Ces résultats suggèrent que l'optimisation est nécessaire pour récupérer le virus de la cible de manière optimale à partir d'une matrice d'eau donnée pour l'utilisation de ces techniques. L'optimisation est beaucoup de temps, processus ardu de nombreux chercheurs évitent activement depuis de nombreuses variables seront évaluées (type de filtre / marque, solution d'élution de pH, célite / floculation organique).
Pour ce sTudy, une procédure a été développée pour identifier les conditions optimales pour la concentration du virus dans l'eau en utilisant l'adénovirus humain pointes souches 40 et 41. On peut supposer que, puisque chaque type de virus affiche une morphologie de capside unique et frais de capside spécifique, peuvent avoir besoin d'être optimisé pour tous les virus protocoles de concentration cibler pour parvenir à une reprise virale optimale. Cette étude fournit une approche pour 40 AdV et 41 concentration par: 1) l'évaluation de récupérations de virus dans l'eau du robinet en utilisant des disques de filtres électropositifs suivis par 2) l'évaluation d'une méthode de floculation organique établie par rapport à la technique de célite comme une concentration secondaire, et 3) l'évaluation des tampons d'élution pour la concentration tertiaire.
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Protocol
1. Préparation de la verrerie et de logements de filtre
- Sauf indication contraire, tous les stériliser la verrerie, des boîtiers et des solutions de filtrage à 121 ° C pendant 15 min. Pour assurer la stérilité, couvrir toutes les ouvertures ou les surfaces exposées avec soit une feuille d'aluminium ou de papier de bande sécurisé avant la stérilisation.
- Assembler appareil de filtration en attachant boîtier de filtre (diamètre 47 mm) à une branche latérale L erlenmeyer. Recueillir les filtres nécessaires: diamètre 47 mm filtres à disques électropositifs / électronégatif.
- Préparer 1 L de 1,5% d'extrait de boeuf (floculation; produit des particules de floc lorsque le pH de la solution est abaissé à 3,5, ou non-floculant, ce qui ne est pas globale à pH 3,5), avec 0,05 M de glycine, en dissolvant 15 g d'extrait de boeuf dans 1 L d'eau désionisée et en ajoutant 3,75 g de glycine.
REMARQUE: extraits non-floculants boeuf nécessiteront l'ajout de célite avant concentration tertiaire. - Ajouter élution polyph additif de sodiumosphate d'extrait de boeuf à une concentration de 0,1%.
- Ajouter solution 1 M d'acide chlorhydrique, goutte à goutte, le mélange extrait de boeuf, solution de pH à pH désiré. Extrait de boeuf autoclave pendant 15 à 30 min à 121 ° C.
- Mesurer 0,1 g de fines, moyennes ou grandes particules de célite (pour une utilisation avec non-floculation extrait de boeuf seulement).
- Préparer vide / aspiration par fixation de tubes compatible Erlenmeyer bras latéral ballon et à la sortie de vide.
2. Préparation des solutions et Virus Stock
- Préparer 1 L de HCl 1.
- Préparer 1 litre de 1 M de NaOH.
- Préparer la solution 1x PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 1,47 mM K 2 PO 4 et 4,3 mM NaH 2 PO 4).
- Ajuster le pH de 1 x PBS à 9,0 en utilisant du NaOH 1 M.
- Préparer et diluer stock de virus à 10 4 -10 5 nombre le plus probable (NPP) ml -1 en mélangeant 1 ml de stock de virus avec 9 ml de PBS (pH7), comme précédemment décrit 8,13. Conserver à -80 ° C en aliquots de 1 ml.
- Stériliser stock de virus par filtrage de la seringue (0,22 um de taille de pores) pour éliminer les contaminants potentiels.
- Déchlorée eau du robinet
- Mesure 1 L d'eau du robinet stérile en utilisant une solution stérile graduée et verser dans un bêcher de 2 L contenant une barre d'agitation magnétique.
- Ajouter 0,7 g de thiosulfate de sodium et mélanger jusqu'à ce que les granules se dissolvent. Ajuster le pH de l'eau du robinet à 7-7,5 si nécessaire l'aide de M HCl 1 ou une solution M NaOH.
- Pic de virus Thaw (1 ml) et ajouter du volume entier de pic à 1 L d'eau du robinet déchlorée stérile. Mélanger pendant 10 minutes.
- Préparer un blanc de méthode (de l'eau du robinet déchlorée sans adénovirus) avec chaque expérience et le processus de la même manière que l'échantillon enrichi.
3. Préparation de Millipore Filtre Appareil
- Retirer couche stérile sur le boîtier du filtre. Assurerbon ajustement entre le boîtier de filtre bol supérieur et l'écran inférieur du filtre pour éviter les fuites échantillon lors de la filtration.
- Retirez protection stérile de 1 L erlenmeyer. Assurez-vous que le bouchon de l'unité de filtre se adapte parfaitement dans l'ouverture supérieure du erlenmeyer, créant une bonne étanchéité.
- Retirer la partie supérieure du bol unité de filtre de l'écran de filtre inférieure et placer 47 mm disque filtrant électropositif carrément sur l'écran avec des pinces stériles. Fixez logements cuve du filtre à l'écran en bas et le verrouiller en place en tournant dans le sens antihoraire.
4. Appuyez de filtration d'eau (concentration primaire)
- Mesurer 100 ml de virus dopés l'eau du robinet en utilisant stérile graduée.
- Verser 100 ml d'eau du robinet virus ensemencés dans le boîtier de filtre contenant soit un / filtre de cellulose 47 mm verre à plis ou un filtre à disque en fibres nano-alumine / verre.
- Permettre à l'eau de passer lentement à travers le filtre. Appliquer une dépression douce pour enlever les résidus restants of eau du robinet à partir de la surface du filtre.
- Si l'on utilise un traitement à la trypsine, ajouter 5 ml de trypsine à 0,25% pour filtrer surface et incuber pendant 5 min.
- Laver la trypsine à partir de la surface du filtre avec 50 ml d'eau désionisée stérile.
5. Virus élution de filtre
- Déposer le boîtier de filtre de 2 L Erlenmeyer et placez sur 250 ml bras latéral flacon.
- Mesurer 100 ml d'extrait de boeuf en utilisant graduée. Verser lentement 100 ml d'extrait de boeuf dans le boîtier de filtre.
- Laisser extrait de boeuf à verser à travers un filtre, capturant extrait de boeuf dans un petit (250 ml) Erlenmeyer. Appliquer le vide pour passer à travers l'extrait résiduelle de boeuf du filtre.
6. Celite Concentration secondaire
- flacons de transfert contenant les virus élues à une plaque d'agitation. Ajouter barreau magnétique stérile et lieu sur la plaque d'agitation, le mélange pour créer légère vortex.
- Ajouter 0,1 g de célitepoudre à 100 ml d'extrait de boeuf et laisser célite pour disperser. Placez la sonde de pH stérile dans l'extrait de boeuf.
- Ajouter goutte à goutte de l'HCl 1 à l'extrait de boeuf pour obtenir un pH 4,0. Laisser mélanger lentement pendant 10 min.
- Placer 47 mm pré-filtre sur le boîtier de filtre (comme décrit précédemment) en utilisant un flacon Erlenmeyer de 2 litres.
- Verser 100 ml d'extrait de boeuf / mélange de Celite sur pré-filtre. Laisser extrait de boeuf de verser à travers. Appliquer une légère vide pour tirer à travers extrait résiduelle de boeuf du filtre.
- Passer clip métallique sur l'extrémité de boîtier de filtre bec. Attacher 15 ml collection de polypropylène tube stérile de clip en métal. Placez boîtier de filtre dans erlenmeyer.
- Ajouter 5 ml de tampon 1 x PBS, pH 9,0 sur de la Celite recueillies sur le pré-filtre.
- Laisser se écouler à travers PBS pré-filtre. Appliquer une légère vide pour tirer à travers PBS résiduelle dans 15 ml tube de collecte.
7. floculation organique Concentration secondaire
- Transférez les béchers contenant le virus élué à une plaque d'agitation. Ajouter barreau magnétique stérile pour 100 ml d'extrait de boeuf et mélanger pour créer légère vortex.
- Placez la sonde de pH stérile dans l'extrait de boeuf.
- Ajouter 1 M HCl goutte à goutte à l'extrait de boeuf et ajuster le pH à 3,5. Mélanger pendant 30 minutes.
- Verser l'éluat dans 250 ml tubes coniques centrifugeuse et centrifuger à 2500 g pendant 15 min à 4 ºC.
- Verser le surnageant en prenant soin de ne pas de ne pas perturber le culot. Remettre en suspension le culot dans 5 ml de 1 x PBS, pH 9.
- Centrifuger la suspension à 4000 xg pendant 10 min à 4 ºC. Verser le surnageant et jeter le culot.
- Ajuster le pH à 7-7,5, stériliser par filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 pm et de congélation à -80 ° C.
8. Viral Nucleic Acid Extraction
- Extraire les acides nucléiques viraux en utilisant un kit commercial approprié conformément aux instructions du fabricant.
- Utilisation des amorces et des sondes, ainsi que son mélange réactionnel et les profils de cycles thermiques tel que publié 8,13.
NOTE: limite estimée de détection du test est d'environ 5 unités qPCR par réaction. - Ajouter des composants de PCR mélanges d'amplification à des concentrations de la manière suivante: Tris 10 mM (pH 8,3), 50 mM de KCl, 4,5 mM MgCl 2 mM dNTP 10, 10 uM des amorces et une sonde uM et 0,5 ul de polymerase de sorte que les volumes finaux de 45 pi peut être ajouté au nombre approprié de puits dans une plaque de réaction de PCR de 96 puits.
- Charge 45 pi de mélange d'amplification par PCR dans chaque puits approprié d'un puits 96, une plaque de réaction de PCR rapide.
- Ajouter 5 ul d'ADN extraites échantillon dans les puits appropriés de la plaque PCR.
- Couvrir la plaque avec joint de couvercle résistant à la chaleur, tourner la plaque de déplacer les gouttelettes en bas du puits de la plaque PCR.
- Définissez cycles d'amplification par PCR que Follux: 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 sec et 60 ° C pendant 1 min.
10. Les analyses de données
- Analyser les mesures triple des dilutions en série de 5 fois des échantillons couvrant 1: 5-1: gamme 625 de dilution afin de déterminer le nombre le plus probable (NPP) des particules virales, comme décrit précédemment 8,13.
- Analyser des dilutions en série de 5 fois de pointes expérimentales adénovirus couvrant 1: 5-1: gamme de dilution 15 625 afin de déterminer le nombre le plus probable (NPP) des particules virales.
- Utilisation de la calculatrice EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), régler la calculatrice pour tenir compte de type de dilution (1: 5 ou 01h10), le nombre de dilutions effectuées, et le nombre de répliquer des échantillons en série de dilution.
- Effectuer log 10 transformation des données, suivi par la normalisation à une unité de volume (par exemple, 1 ml, 100 ml, etc.
- Évaluer l'effet des différentes variables expérimentales (par exemple, différents types CELITE gammes de pH, différents types de filtres et différentes techniques de concentration secondaire) sur les recouvrements AdV en effectuant des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques (par exemple, test t apparié, un ou deux -way ANOVA) en fonction de la distribution des données et la conception expérimentale.
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Representative Results
Sélection Celite
Trois types de célite différents ont été testés avant la sélection de la meilleure variante performante. Celites avec amende à particules moyennes produites les recouvrements d'adénovirus plus élevés. Utilisation de plus grandes celites a entraîné la diminution des recouvrements à la fois pour AdV40 et 41 (entre 32% -100%) (figure 1). Taux moyens de récupération de l'adénovirus 40 étaient 144% ± 52% (fine), 115% ± 28% (moyenne) et 82% ± 53% celites (grande) de particules et AdV41, 132% ± 39% (fine), 83% ± 25% (moyenne) et 50% ± 11% (large). Une ANOVA à un facteur a indiqué la technique de célite optimisé récupéré niveaux statistiquement similaires de AdV40 (P = 0,7920) et 41 (P = 0,1439) à celui de la méthode de floculation organique, qui a récupéré 75% ± 19% et 109% ± 16%, respectivement . La figure 1 illustre les différences entre les techniques de concentration et secondaires entre les types Adv.
_content "> l'évaluation de type de filtreUne centaine de volumes d'un millilitre de virus enrichi, l'eau du robinet ont été concentrées en utilisant soit un verre / cellulose plissé et / ou filtre à disque en verre de nano-fibres d'alumine et ont été traitées en utilisant soit la méthode de la célite ou de floculation organique. Les filtres ont été élues avec extraits de boeuf à pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 et 12 afin de déterminer qui serait le plus efficace dans élution particules AdV des filtres. Le filtre de verre / cellulose couplé avec de l'extrait de boeuf à pH 10 et célite, produit les plus hauts taux de récupération (par qPCR / MPN) pour AdV40 (52% ± 22%) et AdV41 (64% ± 4%) qui sont représentées dans les figures 2 et 3. EXTRAIT DE BOEUF pH 10 récupéré AdV41 significativement plus élevés que toutes les autres valeurs de pH (gamme P de valeur: de 0,0045 à 0,041), tandis que AdV40 suivi une semblable, bien que la tendance un peu plus faible (gamme P de valeur: 0,025 à 0,042). Un filtre de verre / cellulose a également été évaluée en liaison avec l'flocculatio organiquen méthode. Pour AdV40, recouvrements significativement plus élevés ont été acquises en utilisant l'extrait de boeuf pH 10 (40% ± 10%) (gamme P de valeur: 0,010 à 0,027), et pour AdV41, tant 9,5 pH et 10 ont surpassé tous les autres extrait de boeuf pH testé (plage de valeurs de P : 0,023 à 0,027) (figures 2 et 3). Dans l'ensemble, la technique de la celite avec de l'extrait de boeuf pH 10 se est révélée être supérieure à la méthode de floculation organique en comparaison directe pour la récupération des deux souches Adv.
Optimisations des additifs de l'extrait de boeuf
Le procédé optimisé (verre / filtre de cellulose en utilisant l'extrait de boeuf pH 10 couplé avec de la Celite concentration secondaire) a été comparé à deux autres traitements: 1) l'addition de 0,25% de trypsine et 2) complétant l'extrait de boeuf avec du polyphosphate de sodium à 0,1%. L'addition de trypsine ne semble pas améliorer le recouvrement des AdV que seulement 16% ± 6% et 24% ± 14% de AdV40 et 41 entrées, respectivement ont été récupérés (< strong> Figure 4). Extrait de boeuf additionné de polyphosphate de sodium à 0,1% a donné les plus hauts taux de récupération de 41 AdV40 et par rapport à celle de la méthode précédente optimisé. Récupération AdV40 semble augmenter de 13%, et la récupération AdV41 augmenté de 7% par rapport à la méthode précédente, mais ni était statistiquement significative (valeur P: 0,146). L'utilisation de pourcentages plus élevés de polyphosphate de sodium 1%, 3% et 5% (données non montrées) se est révélée être inefficace, ce qui nécessite de grands volumes d'acide pour ajuster le pH de ces solutions à 4,0 lors de la concentration secondaire.
Figure 1: Le pourcentage de récupération de AdV-40 et AdV-41 basé sur la technique de concentration secondaire (Celite contre floc biologique) et du type de Celite utilisé. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 3) 8.
Figure 2: Le pourcentage de récupération des AdV-40 utilisant deux types de techniques de concentration secondaires (Celite et floc biologique) et deux types de filtres (Verre / cellulose et Nano-alumine / verre) à différents niveaux de l'extrait de boeuf de pH. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 3) 13.
Figure 3: Le pourcentage de récupération des AdV-41 utilisant deux types de techniques de concentration secondaires (Celite et floc biologique) et deux types de filtres (Verre / cellulose et Nano-alumine / verre) à différents niveaux de l'extrait de boeuf de pH. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 3) 13.
Figure 4: L'effet des additifs d'élution sur la récupération des AdV 40 et 41 AdV concentrée en utilisant Celite comme une technique de concentration secondaire et verre / cellulose. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 3) 13.
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Discussion
Filtres électropositifs sont utiles à concentrer virus de l'eau; Cependant, ces filtres peuvent différer dans leur structure et la composition qui pourrait à son tour modifier leur efficacité. Se ajoute à ce problème, les structures et les charges varient capside entre les souches de virus nécessitant des techniques de concentration être adaptés pour assurer une récupération optimale 15. Grâce à des modifications simples des techniques de concentration existants (par exemple, filtres électropositifs, extrait de bœuf élution), la concentration plus efficace des virus de la cible peut être atteinte 16,17.
Jusqu'ici les recherches ont généralement porté sur la récupération du virus en modifiant la concentration primaire (filtres) étapes, mais peu d'attention a été accordée à des procédures de concentration ultérieures qui pourraient également influencer la récupération du virus 18. Il a été démontré que les différentes techniques de concentration secondaires peuvent affecter 6,13,19,20 récupérations de virus. Celite concentration a été montré pour récupérer des niveaux similaires de virus à celle des autres procédés de concentration 8,14 secondaires à partir d'une variété de matrices, tout en utilisant des procédures rapides et de traitement des échantillons simples.
Du fait de faire varier les structures de capside externe, certains virus peuvent devenir physiquement piégé à l'intérieur de la matrice de filtre 21, ce qui nécessite l'évaluation des différents additifs pour filtrer les protocoles d'élution. Par exemple, l'addition de tensio-actif, de polyphosphate de sodium améliore à la fois la récupération bactérienne et virale au cours de concentration primaire 6,13,22-24. D'autre part, faibles taux de récupération observés après l'addition de trypsine indiquent que les protéases ne aident pas dans le clivage des fibres protéiques sur la capside virale externe. En outre, alors pas rare 7,25,26, il est à noter que certains de nos recouvrements étaient de plus de 100%. Comme montré précédemment 7,25,26, ce est probablement due à l'agglutination de laboratoire préparé virus utilisé comme pic.
Le petit volume (100 ml virus dopés eau) approche de concentration présenté peut être un moyen pratique de développer et d'optimiser les méthodes de concentration de virus, en raison de sa simplicité et sa faible consommation des ressources ainsi que le temps de traitement rapide de l'échantillon. L'utilisation de tels petits volumes d'eau, la concentration d'inhibiteurs de la PCR dans l'échantillon est également réduit, mais il est recommandé que chaque source d'eau pour évaluer la présence d'inhibiteurs de PCR avant l'expérimentation. Depuis existe de nombreux choix des deux filtres et des techniques de concentration secondaires, petites techniques de concentration de volume permettent des évaluations rapides de nombreuses variables. Il est à espérer que ces techniques pourraient être déployés avant la filtration d'expérimentation à grande échelle pour aider à identifier les conditions sont optimales pour la concentration de virus de la cible par des matrices d'eau donnés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
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