Introduction
Menschendarmviren sind wichtige Erreger von Wasser übertragenen Krankheiten 1-3, aber sind in der Regel in geringer Anzahl in kontaminierten Umwelt Gewässern, so dass ihr Nachweis schwierig, ohne Konzentration. Verfahren verwendet werden, um Viren zu konzentrieren umfassen typischerweise ein Filtrationsschritt, gefolgt von Filter Elution und Sekundär Konzentration des Filter Eluat. Eine gemeinsame Filtrationsverfahren stützt sich auf den Einsatz von geladenen Membranen wie elektro Filter (vor kurzem in 4,5 überprüft). Diese Filter verlassen sich auf die Erfassung von Viren in Wasser suspendiert, elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der Filteroberfläche (positiv geladen) und gezielte Viruspartikel (negativ geladen). Zwei elektro Filter, die kommerziell verfügbar sind, beruhen auf dieser Technologie, die Glas / Cellulose und Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser-Filtern. Die Glas / Cellulose-Filterkosten um bis zu 10-fache des Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser, das die Verwendung des Glases / ce begrenzenllulose Filter für die routinemäßige Virenüberwachung. Jüngste Studien haben festgestellt, Unterschiede nominal zwischen diesen beiden Filter in der Wiederaufnahme von Enteroviren von Umgebungswasser 6,7 sind, rechtfertigt den Einsatz eines preiswerter Filter Alternative. Weitere Filteroptionen wie elektro und Glaswolle-Filter untersucht worden, aber sie erfordern entweder die Vorbehandlung der Quelle Wasser (elektro Filter) oder nicht im Handel erhältlich (Glaswolle-Filter). Die Entwicklung der Viruskonzentration Verfahren hat sich vor allem auf die Optimierung der primären Konzentrationstechniken (Filter), um Virenrückforderungen aus dem Wasser zu verbessern konzentriert. Allerdings Sekundär Konzentration Verfahren, die das Volumen des Elutionsmittels typischerweise 1 L senken, Volumes Milliliter, kann auch einen erheblichen Einfluss auf die Virus Erholungen 8.
Sekundäre Konzentration von Darmviren beruht in der Regel auf einem Flockungsmittel, wie einige Arten von Rinderextrakt (organische floccunung) oder Magermilch Flockung 9-12 zu Viruspartikeln aus Filterflächen zu entfernen. Kürzlich wurde eine weitere sekundäre Konzentrationsverfahren unter Verwendung von Rinderextrakt zusammen mit der Zugabe von Celite (feine Teilchen) Versprechen zur Rückgewinnung Adenovirus, Enteroviren und Norovirus 8,13,14 gezeigt. Celite Konzentration Arbeiten unter ähnlichen Prinzipien wie die des organischen Ausflockungsverfahren dass Viruspartikel befestigen und von Teilchen (Flocken oder Celite) durch Änderung des pH der Suspension die Lösung freigesetzt. Vergleiche zwischen diesen beiden Sekundär Konzentration Techniken bei der Beitreibung von Stachel Adenovirus (AdV) Typen 40 und 41 8 bewertet worden. Diese Studie ergab, dass die beiden Sekundärkonzentrationstechniken waren in der Wiederaufnahme von Adenoviren statistisch ähnlich. Jedoch erfordert das organische Ausflockungsverfahren 30 min. Inkubation bei pH 3,5, während das Celite Technik erfordert eine kürzere Inkubation (10 min) bei pH 4,0. Die organische flocculatIonen erfordert auch den Einsatz von teuren Laboreinrichtungen (Zentrifugen) Flockenpartikel während tertiäre Konzentration sammeln, das Celite Technik im Gegensatz nur die wichtigsten Laborausrüstung (Vakuumfiltration), um Celite Teilchen aus der Suspension zu trennen.
Bestimmte Kombinationen von Filtern und Sekundär Elutionstechniken kann auch Auswirkungen auf Virus-Rückforderungen. Eine Studie ergab, dass bestimmte Kombinationen von primären (elektro Filter) und sekundäre Konzentrationstechniken (Celite oder organischen Flokkulation) einen signifikanten Einfluss der Erholung von Adenovirus-13 hatte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Optimierung ist, um optimal zu erholen Zielvirus aus einer gegebenen Wassermatrix bei der Verwendung dieser Techniken erforderlich. Optimierung ist ein zeitaufwendiger, aktiv zu vermeiden mühsamer Prozess viele Forscher seit vielen Variablen werden ausgewertet (Filtertyp / Marke pH Elutionslösung, Celite / organischen Flokkulation).
Dafür study, ein Verfahren entwickelt, um optimale Bedingungen für die Viruskonzentration von Wasser zu identifizieren mit Stachel humane Adenovirus-Stämme 40 und 41 Vermutlich da jeder Virustyp zeigt eine einzigartige Kapsid Morphologie und spezifische Kapsid Ladung, müssen Konzentrationsprotokolle für jeden Virus optimiert werden zielen, um eine optimale Virusrückgewinnung zu erreichen. Diese Studie liefert einen Ansatz für die AdV 40 und 41 Konzentration: 1) Auswertung Virus Erholungen in Leitungswasser mittels elektroFilterScheiben, gefolgt von 2) Auswertung eines etablierten organischen Flockungsmethoden gegenüber dem Celite-Technik als Sekundär Konzentration, und 3) Bewertung der Elutionspuffer für tertiäre Konzentration.
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Protocol
1. Herstellung der Glasgeschirr und Filtergehäuse
- Wenn nicht anders angegeben, sterilisieren alle Gläser, Filtergehäuse und Lösungen bei 121 ° C für 15 min. Um die Sterilität zu gewährleisten, decken alle Öffnungen oder freiliegenden Flächen entweder mit Aluminiumfolie oder Klebeband gesicherten Papier vor der Sterilisation.
- Montieren Sie Filtervorrichtung durch Anbringen von Filter-Gehäuse (47 mm Durchmesser) auf 1 L Seitenarm Erlenmeyerkolben. Filter erforderlich sammeln: 47 mm Durchmesser elektro / elektroScheibenFiltern.
- Herstellung von 1 l 1,5% Rinderextrakt (Ausflocken, produziert Flockenpartikel beim pH der Lösung wird auf 3,5 oder nichtflock abgesenkt, das aber nicht bei pH 3,5 hat Aggregat) durch Auflösen von 15 g Rinderextrakt in, mit 0,05 M Glycin, 1 l entionisiertem Wasser und Zugabe von 3,75 g Glycin.
HINWEIS: Nicht-Flockungsmitteln Rindfleischextrakten wird die Zugabe von Celite vor tertiären Konzentration erfordern. - Fügen Elution Additiv Natrium polyphosphate um Rindfleischextrakt in einer Konzentration von 0,1%.
- 1 M Salzsäurelösung tropfenweise von dem Mischungsrindfleischextrakt, pH-Lösung um den gewünschten pH. Autoklav Rindfleischextrakt für 15-30 min bei 121 ° C.
- Messen Sie 0,1 g feine, mittlere oder große Partikel Celite (zur Verwendung mit nicht-Flockungsmittel Rindfleischextrakt nur).
- Bereiten Vakuum / Sog durch das Anbringen kompatibler Schlauch an Erlen Seitenarm Kolben und an die Vakuumsteckdose.
2. Herstellung von Lösungen und Virenvektor
- Herstellung von 1 l 1 M HCl.
- Herstellung von 1 l 1 M NaOH.
- Bereiten 1x PBS-Lösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4 und 4,3 mM NaH 2 PO 4).
- Der pH-Wert von 1 × PBS auf 9,0 unter Verwendung von 1 M NaOH.
- Vorbereiten und verdünnen Lager Virus bis 10 4 -10 5 wahrscheinlichste Zahl (MPN) ml-1 durch Mischen von 1 ml Stammvirus mit 9 ml PBS (pH7), wie zuvor beschrieben, 8,13. Bei -80 ° C in 1 ml-Teilmengen.
- Sterilisieren Virusstamm mit Hilfe einer Spritze Filterung (0,22 um Porengröße), um mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
- Entchlortem Leitungswasser
- Maßnahme 1 l sterilem Leitungswasser mit einer sterilen Messzylinder abgemessen und in einen 2 l-Becherglas mit Magnetrührer.
- Hinzufügen von 0,7 g Natriumthiosulfat und mischen, bis Granulate aufzulösen. Der pH-Wert des Leitungswassers auf 7-7,5 bei Bedarf mit 1 M HCl oder 1 M NaOH-Lösung.
- Thaw Virus Spike (1 ml) und fügen gesamte Volumen der Spitze zu 1 l dechloriert sterilem Leitungswasser. Mischen Sie für 10 Minuten.
- Bereiten Sie eine leere Methode (dechloriert Leitungswasser ohne Adenovirus) mit jedem Experiment und Verfahren in der gleichen Weise wie der angereicherten Probe.
3. Herstellung von Millipore Filtergerät
- Entfernen steriler Verband Filtergehäuse. Dafür Sorgengute Passform zwischen den Filtergehäuseoberschale und unteren Filter Bildschirm Probe Leckage während der Filtration zu vermeiden.
- Entfernen sterilen Abdeckung von 1 l Erlenmeyerkolben. Sicherzustellen, dass der Korken von der Filtereinheit paßt genau in die obere Öffnung des Erlenmeyerkolben, der eine gute Abdichtung.
- Entfernen Sie die obere Schale mit Filtereinheit von der unteren Filterscheibe, und legen Sie 47 mm elektroFilterScheibe direkt über Bildschirm mit einer sterilen Pinzette. Befestigen Sie Filtergehäuse Schüssel zum unteren Bildschirm und einrasten durch Verdrehen gegen den Uhrzeigersinn.
4. Tippen Sie auf Wasserfiltration (Primary Konzentration)
- Messen Sie 100 ml Virus versetzt Leitungswasser mit sterilen Messzylinder.
- Gießen Sie 100 ml Virus versetzt Leitungswasser in das Filtergehäuse, die entweder ein 47 mm Falten Glas / Cellulose-Filter oder eine Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser-Scheibenfilter.
- Damit das Wasser langsam durch Filter. Bewerben leichtem Vakuum, um die verbleibenden Reste zu entfernen of Leitungswasser aus Filterfläche.
- Bei der Verwendung von Trypsin-Behandlung, 5 ml 0,25% Trypsin, um Oberflächen filtern und Inkubation für 5 min.
- Von Filterfläche mit 50 ml sterilem deionisiertem Wasser waschen Trypsin.
5. Virus Elution von Filter
- Entfernen Sie Filtergehäuse aus zwei L-Erlenmeyerkolben, und setzen Sie auf 250 ml Seitenarm Kolben.
- Messen Sie 100 ml Fleischextrakt unter Verwendung von Messzylinder. Gießen Sie langsam 100 ml Fleischextrakt in das Filtergehäuse.
- Lassen Rindfleischextrakt durch Filter gießen, der Erfassung Rindfleischextrakt in einem kleinen (250 ml) Erlenmeyerkolben. Gib Vakuum durch Restfleischextrakt aus dem Filter zu ziehen.
6. Celite Sekundär Konzentration
- Transfer-Kolben, die die eluierten Viren auf einer Rührplatte. In sterilen Magnetrührer und auf Rührplatte, Mischen zu leichten Wirbel zu erzeugen.
- Mit 0,1 g CelitePulver zu 100 ml Fleischextrakt und lassen Celite zu zerstreuen. Zeigen sterile pH-Sonde in Fleischextrakt.
- Fügen tropfenweise 1 M HCl auf Rindfleischextrakt auf pH 4,0 zu erreichen. Lassen Sie langsam mischen für 10 min.
- Platz 47 mm-Vorfilter auf Filtergehäuse (wie zuvor beschrieben) mit einem 2 l-Erlenmeyerkolben.
- Gießen Sie 100 ml Fleischextrakt / Celite-Mischung über Vorfilter. Lassen Rindfleischextrakt durch gießen. Mit leichtem Unterdruck, durch Restfleischextrakt aus dem Filter zu ziehen.
- Zeigen Metallrohr Clip auf Ende des Filtergehäuses Auslauf. Bringen sterile 15 ml-Polypropylen-Sammelrohr, um Metallrohr Clip. Zeigen Filtergehäuse zurück in Erlenmeyerkolben.
- 5 ml 1x PBS-Puffer, pH 9,0 über Celite am Vorfilter gesammelt.
- Lassen PBS durch Vorfilter tropfen. Mit leichtem Unterdruck, durch Rest PBS in 15 ml Sammelröhrchen zu ziehen.
7. Organische Flockung Sekundär Konzentration
- Übertragen Sie die Becher, die das eluierte Virus auf einer Rührplatte. In sterilen Magnetrührer zu 100 ml Fleischextrakt und mischen, um leichten Wirbel zu erzeugen.
- Zeigen sterile pH-Sonde in Fleischextrakt.
- 1 M HCl tropfenweise zu Rindfleischextrakt und pH-Wert auf 3,5. Mischen für 30 min.
- Gießen des Eluats in 250 ml Zentrifugen konische Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.500 xg für 15 min bei 4 ºC.
- Überstand abgießen dabei nicht, das Sediment nicht zu stören. Das Pellet in 5 ml 1x PBS, pH 9.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 4.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand abgießen und verwerfen das Pellet.
- PH-Wert auf 7-7,5 filtersterilisieren durch 0,22 & mgr; m-Spritzenfilter übertragen und bei -80 ° C.
8. viralen Nukleinsäureextraktion
- Extrahieren viralen Nukleinsäuren unter Verwendung eines geeigneten handelsüblichen Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Primer und Sonden sowie den Reaktionsmischung und Temperaturwechselprofile veröffentlicht als 8,13.
Hinweis: Das Nachweisgrenze für den Test ist ca. 5 qPCR Einheiten pro Reaktion. - Hinzufügen von Komponenten einer PCR-Amplifikation Mischungen in Konzentrationen wie folgt: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 & mgr; M Primer und 1 & mgr; M Sonde und 0,5 & mgr; l Polymerase sodass Endvolumen von 45 ul können auf geeignete Anzahl von Wells einer 96-Well-PCR-Reaktionsplatte gegeben werden.
- Last 45 ul der PCR-Amplifikation Mischung zu jedem entsprechenden Vertiefung einer 96-well, schnelle Reaktion PCR-Platte.
- In 5 ul DNA extrahiert Probe Vertiefungen der PCR-Platte.
- Abdeckplatte mit hitzebeständigem Deckeldichtung, drehen Sie die Platte um alle Tröpfchen nach unten von PCR-Plattenvertiefungen zu bewegen.
- Stellen Sie die PCR-Amplifikation Zyklen wie folgt einteilenOWS: 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min.
10. Datenanalysen
- Analysieren Dreifachmessungen der serielle 5-fache Verdünnungen der Proben Spanning 1: 5 bis 1: 625 Verdünnung Bereich um die wahrscheinlichste Zahl (MPN) der Viruspartikel zu bestimmen, wie zuvor beschrieben, 8,13.
- Analysieren serielle 5-fache Verdünnungen von Adenovirus experimentellen Spitzen Spanning 1: 5 bis 1: 15.625 Verdünnung Bereich um die wahrscheinlichste Zahl (MPN) der Viruspartikel zu bestimmen.
- Mit dem EPA MPN Rechner (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), stellen Sie den Rechner, um für Art der Verdünnung zu berücksichtigen (1: 5 oder 1:10), die Anzahl der Verdünnungen durchgeführt, und die Zahl der Parallelproben in Verdünnungsreihen.
- Führen log 10-Transformation der Daten, gefolgt von der Normalisierung auf eine Volumeneinheit (beispielsweise 1 ml, 100 ml, usw.
- Bewerten der Wirkung der verschiedenen experimentellen Parametern (zB unterschiedliche Celite Typen pH-Bereichen, unterschiedliche Filtertypen und verschiedene sekundäre Konzentrationstechniken) auf AdV Einziehungen durch Ausführen parametrischer oder nicht-parametrischen statistischen Tests (zB gepaarter t-Test, ein oder zwei -Wege ANOVA) in Abhängigkeit von der Verteilung der Daten und die Konzeption des Experiments.
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Representative Results
Celite Auswahl
Drei verschiedene Arten von Celite wurden vor der Auswahl des besten Variante getestet. Celite mit feinen bis mittelgroße Partikel produziert die höchsten Adenovirus Erholungen. Einsatz größerer Celite führte zu niedrigeren Wiederfindungsraten für sowohl AdV40 und 41 (Bereich 32% -100%) (Abbildung 1). Durchschnittliche Rückforderungen von Adenovirus-40 waren 144% ± 52% (fein), 115% ± 28% (mittel) und 82% ± 53% (große) Partikel Celite und AdV41, 132% ± 39% (fein), 83% ± 25% (medium) und 50% ± 11% (breit). Einweg-ANOVA zeigte die optimierte Celite Technik gewonnen statistisch ähnlich Ebenen AdV40 (P = 0,7920) und 41 (P = 0,1439) zu der des organischen Ausflockungsverfahren, die 75% ± 19% und 109% ± 16%, jeweils gewonnen . Abbildung 1 zeigt die Unterschiede zwischen den Sekundärkonzentrationstechniken und zwischen AdV-Typen.
_content "> Filtertyp AuswertungHundert Milliliter-Volumina von Virus-dotierten, Leitungswasser wurden entweder mit einem plissierten Glas / Cellulose oder Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser-Scheibenfilter konzentriert und wurden entweder mit dem Celite oder organische Flockungsmethoden verarbeitet. Die Filter wurden mit Rinderextrakten bei pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 und 12 eluiert, um zu bestimmen, welche am effektivsten Eluieren AdV Partikel von den Filtern würde. Das Glas / Cellulosefilter bei pH 10 und Celite gekoppelt mit Rindfleischextrakt, erzeugte die höchsten Ausbeuten (qPCR / MPN) zum AdV40 (52% ± 22%) und AdV41 (64% ± 4%), die in den 2 und dargestellt sind 3. Rindfleischextrakt pH 10 wieder deutlich höher AdV41 als alle anderen pH-Werten (P-Wert Bereich: 0,0045 bis 0,041), während AdV40 folgte einem ähnlichen, wenn auch etwas schwächere Entwicklung (P Wertebereich: 0,025 bis 0,042). Ein Glas / Cellulosefilter wurde in Verbindung mit der organischen flocculatio evaluiertn-Methode. Für AdV40 wurden deutlich höhere Ausbeuten mit Rindfleischextrakt pH 10 (40% ± 10%) (P Wertebereich: 0,010-0,027) gewonnen und für AdV41 sowohl pH 9,5 und 10 besser als alle anderen Fleischextrakt pH getestet (P Wertebereich : 0,023 bis 0,027) (Figuren 2 und 3). Insgesamt ist die Kieselgur-Technik mit Rindfleischextrakt pH 10 wurde festgestellt, über dem organischen Flockungsmethoden im direkten Vergleich für die Wiederherstellung der beiden AdV Stämme zu sein.
Optimierungen der Rindfleischextrakt Zusatzstoffe
1) Zugabe von 0,25% Trypsin und 2) zur Ergänzung des Rindfleischextrakt mit 0,1% Natriumpolyphosphat: Das optimierte Verfahren (Glas / Zellulosefilter mit Rindfleischextrakt pH 10 in Verbindung mit Celite Sekundärkonzentration) wurde zu zwei anderen Behandlungen verglichen. Die Zugabe von Trypsin anscheinend nicht Gewinnung von AdV als nur 16% ± 6% bzw. 24% ± 14% der AdV40 und 41 Eingänge zu verbessern, bzw. wurden gewonnen (< strong> Abbildung 4). Fleischextrakt mit 0,1% Natriumpolyphosphat ergänzt ergab die höchsten Ausbeuten von AdV40 und 41 im Vergleich zu derjenigen des vorhergehenden optimiertes Verfahren. AdV40 Erholung erschien um 13% zu erhöhen und AdV41 Erholung stieg um 7% gegenüber dem bisherigen Verfahren, aber weder war statistisch signifikant (p-Wert: 0,146). Die Verwendung von höheren Prozent Natriumpolyphosphat 1%, 3% und 5% (Daten nicht gezeigt) wurde als unwirksam erwiesen und erfordern große Mengen an Säure, um den pH dieser Lösung auf 4,0 während der sekundäre Konzentration einzustellen.
Abbildung 1: Prozentuale Rückgewinnung von AdV-40 und AdV-41 basierend auf sekundäre Konzentrationstechnik (Celite gegen Organic floc) und der Art des Celite verwendet. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3), 8.
Abbildung 2: Prozentuale Rückgewinnung von AdV-40 unter Verwendung von zwei Arten von sekundären Konzentrierungstechniken (Celite und organischen Flocken) und zwei Arten von Filtern (Glas / Cellulose und Nano-Aluminiumoxid / Glas) bei variierenden pH-Werten von Rinderextrakt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3) 13.
Abbildung 3: Prozentuale Rückgewinnung von AdV-41 unter Verwendung von zwei Arten von sekundären Konzentrierungstechniken (Celite und organischen Flocken) und zwei Arten von Filtern (Glas / Cellulose und Nano-Aluminiumoxid / Glas) bei variierenden pH-Werten von Rinderextrakt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3) 13.
Abbildung 4: Die Wirkung von Additiven auf die Elution Erholung der AdV 40 und 41 konzentriert AdV Verwendung von Celite als sekundäre Konzentrationstechnik und Glas / Cellulose. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3) 13.
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Discussion
Elektro Filter sind nützlich bei der Konzentration von Viren aus Wasser; aber diese Filter können in ihrer Struktur und Zusammensetzung, die wiederum ihre Wirksamkeit verändern könnten abweichen. Compoundierung dieses Problem, Kapsidstrukturen und Gebühren schwanken zwischen Virusstämme erfordern Konzentrationstechniken zugeschnitten auf optimale Erholung 15 zu gewährleisten. Durch einfache Änderungen an den vorhandenen Konzentrierungstechniken (zB elektro Filter, Rindfleischextrakt Elution), können wirksamer Konzentration von Zielviren erzielt 16,17 werden.
Die bisherige Forschung hat sich in der Regel über die Einziehung von Virus, indem Sie Grundkonzentration (Filter) Schritte konzentriert, aber wenig Aufmerksamkeit auf nachfolgende Konzentrationsverfahren, die auch beeinflussen könnten Virus Recovery 18 gegeben. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Sekundärkonzentrationstechniken können Virus Einziehungen 6,13,19,20 beeinflussen. CeliTe-Konzentration ist gezeigt worden, um ähnliche Niveaus der Virus zu der anderen sekundären Konzentration 8,14 Verfahren aus einer Vielzahl von Matrizen zu erholen, während mit schneller und einfacher Probenverarbeitungsverfahren.
Aufgrund der unterschiedlichen äußeren Kapsidstrukturen können bestimmte Viren physikalisch innerhalb der Filtermatrix 21 eingefangen werden, erfordern die Auswertung verschiedener Additive Elutionsprotokolle filtern. Beispielsweise durch Zugabe von Tensid, verbesserte Natriumpolyphosphat sowohl bakterielle und Virusrückgewinnung beim primären Konzentrations 6,13,22-24. Auf der anderen Seite, nach der Zugabe von Trypsin beobachteten niedrigen Ausbeuten zeigen, dass Proteasen nicht zu einer Spaltung der Proteinfasern auf der äußeren Virushülle zu erleichtern. Während außerdem nicht ungewöhnlich 7,25,26, ist es bemerkenswert, dass einige unserer Ausbeute war im Überschuß von 100%. Wie bereits gezeigt, 7,25,26, ist dies wahrscheinlich auf die Verklumpung der im Labor hergestellte virus verwendet als Spike.
Das kleine Volumen (100 ml Virus versetzt Wasser) Konzentration Ansatz vorgestellt kann eine praktische Art und Weise zu entwickeln und zu optimieren Viruskonzentration Methoden, aufgrund seiner Einfachheit und niedrigen Ressourcenverbrauch zusammen mit schnellen Probenbearbeitungszeit. Unter Verwendung solcher kleiner Wassermengen, wird die Konzentration der PCR-Inhibitoren in der Probe minimiert, aber es wird empfohlen, dass jedes Quellwasser für die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren vor dem Experiment evaluiert. Da zahlreiche Möglichkeiten der beiden Filter und sekundäre Konzentrationstechniken vorhanden sind, ermöglichen eine schnelle Bewertung der zahlreichen Variablen kleines Volumen Konzentrationstechniken. Es ist zu hoffen, dass diese Techniken konnte vor Groß Filtration Experimente eingesetzt werden, um bei der Identifizierung, welche Bedingungen für eine optimale Zielviruskonzentration pro gegebenen Wasser Matrizen zu unterstützen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
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