Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Dopaminerge neuronen van minder dan 1% van het totale aantal neuronen in de hersenen. Deze lage hoeveelheid neuronen regelt belangrijke hersenfuncties zoals motorische controle, motivatie, en het werkgeheugen. Nigrostriatale dopaminerge neuronen selectief degenereren bij de ziekte van Parkinson (PD). Deze progressieve neuronale verlies wordt ondubbelzinnig verband met de motoren symptomen van de pathologie (bradykinesia, rust tremor, en spierstijfheid). De belangrijkste agent die verantwoordelijk is van dopaminerge neuronen degeneratie is nog onbekend. Echter, deze neuronen lijken uiterst kwetsbaar in diverse omstandigheden. Primaire kweken vormen een van de meest relevante modellen eigenschappen en kenmerken van dopaminerge neuronen te onderzoeken. Deze culturen kunnen om te stoppen of te vertragen neuronale degeneratie aan verschillende stress-agenten die PD pathologie nabootsen en neuroprotectieve verbindingen worden ingediend. De talrijke transgene muismodellen van PD die gener zijn geweesteerde in het laatste decennium van de belangstelling van onderzoekers voor dopaminerge neuronen culturen verder toegenomen. Hier, de video protocol staat de delicate dissectie van embryonale muizenhersenen. Precieze excisie van ventrale mesencephalon cruciaal is voor neuronale kweken voldoende rijk aan dopaminerge cellen te verkrijgen latere studies laten. Dit protocol kan worden gerealiseerd met embryonale transgene muizen en is geschikt voor immunofluorescentie kleuring, kwantitatieve PCR, tweede messenger kwantificering of neuronale dood / overleving assessment.
Introduction
Dopamine, een van de belangrijkste neurotransmitters 1,2, wordt vooral vrij door dopaminerge (DA) neuronen. De meeste DA neuronen bevinden zich in het ventrale gedeelte van het mesencephalon 2-6. Schematisch kunnen middenhersenen DA neuronen worden onderverdeeld in drie anatomisch en functioneel verschillende projectiesystemen: mesostriatal, mesolimbic en mesocorticale paden 2,5. De nigrostriatale route is betrokken bij motorische gedrag, de mesolimbic wegen spelen een belangrijke rol bij versterking, motivatie en leren, dat de dopaminergische paden projecteert de prefrontale cortex worden betrokken bij cognitie 2.
DA neuronen betrokken zijn bij verschillende menselijke neurologische aandoeningen zoals schizofrenie, aandacht tekort, hyperactiviteit stoornis en de ziekte van Parkinson (PD) 2,4. PD wordt gekenmerkt door een progressieve en selectieve degeneratie van DA neuronen verbinden substantia nigrapars compacta (SNc) het striatum. Het verlies van de nigro-striatale DA neuronen leidt tot ernstige depletie van dopamine in het striatum die verantwoordelijk van de motorische symptomen van PD (bradykinesie, rust tremor, rigiditeit en) 7. De eerste oorzaak van de idiopathische PD is niet vastgesteld en de huidige behandelingen zijn alleen symptomatisch, gericht op het herstellen van dopamine-niveau in het striatum. De meest voorgeschreven geneesmiddel L-Dopa (Levodopa), de natuurlijke voorloper van dopamine. Hoewel de toediening van Levodopa compenseert het verlies van dopamine voor een bepaalde tijd, motorische complicaties optreden na langdurige behandelingen (dyskinesie en on / off toestanden) 8,9.
Onderzoek naar dopaminerge neuronen en PD is in constante progressie en intense inspanningen worden gedaan om behandelingen op basis van stamceltransplantatie, gentherapie, of neuroprotectieve agenten 10,11 ontwikkelen. Echter, een groot probleem nog niet opgehelderd: wat is de oorzaak van de extreme vulnerabiliteit van DA neuronen? Een deel van het antwoord is te vinden in de activiteit van de DA neuronen. Een verlaging van de elektrische activiteit en de prikkelbaarheid van DA neuronen lijkt hun neiging te degenereren 12 vergroten. Toch is de complexiteit van de PD pathogenese vereist verdere studies aan de bij DA mechanismen neuronen degeneratie 13-15 identificeren.
Primaire culturen zijn vooral relevant voor DA neuron eigenschappen 16-19 te bestuderen en deze neuronen aan verschillende spanningen uitdaging voor de evaluatie van neuroprotectieve agenten 20-24. Rat kweekmodellen worden meestal gebruikt als de ontleding van rat embryo mesencephalon is eenvoudiger in vergelijking met de muis en grotere hoeveelheden neuronen kan worden verkregen in de rat. Echter, generatie van transgene muismodellen van de ziekte 25 aanzienlijk het belang van de neurowetenschapper community voor primaire culturen van de muis 26-29 toegenomen. Hoewel culturen prepared van pasgeboren dieren kunnen worden gebruikt, is het beter om te bereiden uit embryo op post-mitotische fase (E13.5 voor mesencephalon neuronen), wanneer neuronen hun vermogen om onderscheid te hebben behouden. Het volgende protocol toont geïsoleerd mesencephalon neuronen in primaire kweek van muizenembryo's (E13.5), die het meest moeilijk te bereiden. Name, bieden we een protocol met behulp van serum-vrij kweekmedium voor een betere reproduceerbaarheid. De twee meest kritische stappen in de cultuur voorbereiding (dissectie en mechanische dissociatie) zal zorgvuldig worden uitgewerkt in de bijbehorende video.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol geeft de procedures en reagentia die nodig zijn om een primaire kweek van mesencefale neuronen Uitgaande van de embryonale muis en immunofluorescentie procedure dopaminerge neuronen detecteren. Kritische stappen van de procedure zijn de dissectie van de embryo's en de mechanische dissociatie van de verzamelde hersenen fragmenten. Hoge kwaliteit dissectie instrumenten helpt om de dissectie techniek onder de knie. DA neuronen vormen een klein deel van mesencephalon. Dienovereenkomstig verzamelt het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
