Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Dopaminerge neuroner representerer mindre enn 1% av det totale antall av neuroner i hjernen. Dette lav mengde nevroner regulerer viktige hjernefunksjoner som for eksempel motorisk kontroll, motivasjon og arbeidsminne. Nigrostriatale dopaminerge nevroner selektivt degenerere i Parkinsons sykdom (PD). Denne progressive neuronal tap er utvetydig forbundet med motorer symptomer på patologi (bradykinesi, hviler tremor, og muskelstivhet). De viktigste agent ansvarlig for dopaminerge nevroner degenerasjon er fortsatt ukjent. Men disse neuronene ser ut til å være meget sårbare i ulike forhold. Primære kulturer utgjør en av de mest relevante modeller for å undersøke egenskaper og karakteristikker av dopaminerge nevroner. Disse kulturene kan sendes til ulike stress agenter som etterligner PD patologi og til nervecellene forbindelser for å stoppe eller bremse ned neuronal degenerasjon. De mange transgene mus modeller av PD som har vært generrerte i løpet av det siste tiåret ytterligere økt interesse av forskere for dopaminerge nevroner kulturer. Her fokuserer video-protokollen på den delikate disseksjon av embryonale mus hjerner. Presis eksisjon av ventral mesencephalon er avgjørende for å oppnå nevronale kulturer tilstrekkelig rik på dopaminerge celler for å tillate etterfølgende studier. Denne protokollen kan realiseres med embryonale transgene mus og er egnet for immunfluorescens farging, kvantitativ PCR, andre messenger kvantifisering, eller neuronal død / overlevelse vurdering.
Introduction
Dopamin, en av de essensielle hjerne nevrotransmittere 1,2, er hovedsakelig frigjort ved midthjernen dopaminerge neuroner (DA). Flertallet av DA nevroner bor i ventral del av mesencephalon 2-6. Skjematisk kan midthjernen DA nevroner deles i tre anatomisk og funksjonelt distinkte projeksjon systemer: mesostriatal, mesolimbiske og mesocortical veier 2,5. Den nigrostriatal veien er involvert i motorisk adferd, mesolimbic trasé spille en viktig rolle i forsterkning, motivasjon og læring, mens de dopaminerge trasé prosjektering til prefrontal cortex er innblandet i kognisjon to.
DA-nevroner er involvert i flere humane nevrologiske lidelser så som schizofreni, oppmerksomhetssvikt, hyper-aktivitet uorden, og Parkinsons sykdom (PD) 2,4. PD er preget av en progressiv og selektiv degenerasjon av DA nevroner koble substantia nigraPars comp (SNC) til striatum. Tapet av Nigro-striatal DA nevroner resulterer i alvorlig dopamin uttømming i striatum som er ansvarlig for de motoriske symptomer på PD (bradykinesi, hviler tremor, og stivhet) 7. Den opprinnelige årsaken til idiopatisk PD er ikke klarlagt, og de nåværende behandlinger er kun symptomatisk, med sikte på å gjenopprette dopamin nivået i striatum. Den mest legemiddelet er L-dopa (levodopa), den naturlige forløper for dopamin. Selv om administrasjon av Levodopa kompenserer for tapet av dopamin for en viss tid, oppstår motoriske komplikasjoner etter langvarig behandling (dyskinesi og av / på statene) 8,9.
Forskning på dopaminerge nevroner og PD er i konstant progresjon og intens innsats blir gjort for å utvikle behandlinger basert på celletransplantasjon, genterapi, eller neurobeskyttelsesmidler 10,11. Imidlertid gjenstår et stort problem som ikke er belyst: Hva er årsaken til den ekstreme vulnerability av DA nevroner? En del av løsningen kan finnes i aktiviteten av DA-nevroner. En reduksjon i den elektriske aktiviteten og av oppstemthet av DA nevroner ser ut til å utfylle deres tilbøyelighet til å utarte 12. Likevel kompleksiteten i PD patogenesen krever videre studier for å identifisere de mekanismene som er involvert i DA nevroner degenerasjon 13-15.
Primærkulturer er spesielt relevant å studere DA neuron egenskaper 16-19 og å utfordre disse nevronene til ulike påkjenninger for evaluering av neurobeskyttelsesmidler 20-24. Rotte kulturmodeller er oftest benyttet, som disseksjon av rotte embryo mesencephalon er enklere, sammenlignet med mus, og høyere mengder av neuroner kan fås hos rotter. Imidlertid har generasjon av transgene mus modeller av sykdommen 25. betydelig økt interesse av hjerneforsker samfunnet for primærkulturer fra musen 26-29. Selv kulturer prepared fra nyfødte dyr som kan brukes, er det bedre å forberede dem fra embryoer ved post-mitotiske trinn (E13.5 for Mesencephalon neuroner), når neuroner har beholdt sin evne til å differensiere. Følgende protokoll presenterer isolerte mesencephalon nevroner i primærkultur fra mus embryoer (E13.5), som er de vanskeligste å forberede seg. Spesielt gir vi en protokoll ved hjelp av serum-fri kultur medium for en bedre reproduserbarhet. De to mest kritiske trinn i fremstillingen kultur (disseksjon og mekanisk dissosiasjon) vil bli nøye beskrevet i den tilhørende video.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen presenterer de prosedyrer og reagenser som er nødvendige for å forberede en primær kultur mesencephalic nevroner fra embryonale mus og immunfluorescens prosedyre for å oppdage dopaminerge nevroner. Kritiske trinn i fremgangsmåten er de disseksjon av embryoene og mekanisk dissosiasjon av de innsamlede hjerne fragmenter. Høy kvalitet disseksjon instrumenter bidrar til å mestre disseksjon teknikk. DA-nevroner utgjør en liten andel av mesencephalon. Følgelig, samle den høyre delen av ventral mese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
