Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Dopaminerga neuroner utgör mindre än 1% av det totala antalet neuroner i hjärnan. Denna låga mängd nervceller reglerar viktiga funktioner i hjärnan såsom motorstyrning, motivation och arbetsminne. Nigrostriatala dopaminerga neuroner selektivt degenererar vid Parkinsons sjukdom (PD). Denna progressiva neuronal förlust entydigt förknippad med motorer symptom av patologin (bradykinesi, vila tremor och muskelstelhet). Den viktigaste agent som ansvarar för dopaminerga neuron degeneration är fortfarande okänd. Dessa nervceller verkar vara extremt sårbara i olika förhållanden. Primära kulturer utgör en av de mest relevanta modeller för att undersöka egenskaper och kännetecken för dopaminerga neuroner. Dessa kulturer kan lämnas in till olika stressmedel som efterliknar PD patologi och nervskyddande föreningar för att stoppa eller bromsa neuronal degeneration. De många transgena musmodeller av PD som har geneUnder det senaste decenniet betat ökade ytterligare intresset för forskare för dopaminerga neuron kulturer. Här fokuserar video protokoll om den känsliga dissekering av embryonala mus hjärnor. Exakt excision av ventrala mesencephalon är avgörande för att få neuronala kulturer är tillräckligt rika på dopaminerga celler för att möjliggöra efterföljande studier. Detta protokoll kan realiseras med embryonala transgena möss och är lämplig för immunofluorescensfärgning, kvantitativ PCR, andra budbärare kvantifiering eller nervcellsdöd / överlevnadsbedömning.
Dopamin, en av de viktigaste signalsubstanserna i hjärnan 1,2, huvudsakligen släpptes av mitthjärnan dopaminerga (DA) nervceller. Majoriteten av DA-neuroner bosatta i den ventrala delen av mesencephalon 2-6. Schematiskt kan mitthjärnan DA nervceller delas in i tre anatomiskt och funktionellt distinkta projektionssystem: mesostriatal, mesolimbiska och mesocortical vägar 2,5. Den nigrostriatala vägen är involverad i motorbeteende, de mesolimbiska vägar spelar en viktig roll i förstärkning, motivation och lärande, medan de dopaminerga vägar skjuter till prefrontala cortex är inblandade i kognition 2.
DA nervceller är inblandade i flera mänskliga neurologiska sjukdomar som schizofreni, uppmärksamhetsstörning, hyper aktivitetsstörning, och Parkinsons sjukdom (PD) 2,4. PD karakteriseras av en progressiv och selektiv degeneration av DA neuron ansluter substantia nigrapars compacta (SNC) till striatum. Förlusten av Nigro-striatala DA neuron i svår dopaminbrist i striatum som ansvarar för de motoriska symtomen vid PS (bradykinesi, vila tremor och rigiditet) 7. Den ursprungliga orsaken till idiopatisk PD har inte fastställts och de nuvarande behandlingar är endast symtomatisk, som syftar till att återställa dopaminnivån i striatum. Den mest förskrivna läkemedlet är L-Dopa (Levodopa), den naturliga föregångare till dopamin. Även administrering av Levodopa kompenserar för förlusten av dopamin under en viss tid, motoriska komplikationer uppstår efter långtidsbehandling (dyskinesi och on / off stater) 8,9.
Forskning om dopaminerga nervceller och PD är i ständig utveckling och intensiva ansträngningar görs för att utveckla behandlingar baserade på celltransplantation, genterapi, eller nervskyddande medel 10,11. Dock kvarstår en viktig fråga som inte klar: Vad är orsaken till den extrema vulnerabbilitet i DA nervceller? En del av svaret finns i aktiviteten av DA-neuroner. En minskning av den elektriska aktiviteten och retbarhet av DA neuron tycks öka deras benägenhet att urarta 12. Trots komplexiteten i PD patogenes kräver ytterligare studier för att identifiera de som är involverade i DA mekanismer nervceller degeneration 13-15.
Primära kulturer är särskilt relevant att studera DA neuron fastigheter 16-19 och utmana dessa neuroner till olika påfrestningar för utvärdering av neuroskyddande medel 20-24. Rat odlingsmodeller används oftast, eftersom dissekering av råttembryo mesencephalon är lättare, jämfört med musen, och större mängder av nervceller kan erhållas hos råtta. Men generation av transgena musmodeller av sjukdomen 25 har betydligt ökat intresse hjärnforskare community för primära kulturer från musen 26-29. Fastän kulturer prepared från nyfödda djur kan användas, är det bättre att förbereda dem från embryon vid post-mitotiska stadiet (E13.5 för mesencephalon neuroner), när nervceller har behållit sin förmåga att differentiera. Följande protokoll består av isolerade mesencephalon nervceller i primär kultur från musembryon (E13.5), som är den svåraste att förbereda. Notably, tillhandahåller vi ett protokoll med användning av serumfritt odlingsmedium för en bättre reproducerbarhet. De två mest kritiska stegen i förberedelserna kultur (dissekering och mekanisk dissociation) kommer att noggrant beskrivs i den tillhörande videon.
Detta protokoll presenteras de förfaranden och reagens som är nödvändiga för att förbereda en primärkultur mesencefala nervceller från embryonala musen och immunofluorescens förfarandet för att upptäcka dopaminerga neuroner. Kritiska steg i proceduren är dissektion av embryon och mekaniska dissociation av de insamlade hjärnfragment. Hög dissektion instrument kvalitet hjälper till att behärska dissektion tekniken. DA nervceller utgör en liten del av mitthjärnan. Således samla den högra delen av den ve…
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |