Summary

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Published: September 08, 2014
doi:

Summary

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

Dopaminerga neuroner utgör mindre än 1% av det totala antalet neuroner i hjärnan. Denna låga mängd nervceller reglerar viktiga funktioner i hjärnan såsom motorstyrning, motivation och arbetsminne. Nigrostriatala dopaminerga neuroner selektivt degenererar vid Parkinsons sjukdom (PD). Denna progressiva neuronal förlust entydigt förknippad med motorer symptom av patologin (bradykinesi, vila tremor och muskelstelhet). Den viktigaste agent som ansvarar för dopaminerga neuron degeneration är fortfarande okänd. Dessa nervceller verkar vara extremt sårbara i olika förhållanden. Primära kulturer utgör en av de mest relevanta modeller för att undersöka egenskaper och kännetecken för dopaminerga neuroner. Dessa kulturer kan lämnas in till olika stressmedel som efterliknar PD patologi och nervskyddande föreningar för att stoppa eller bromsa neuronal degeneration. De många transgena musmodeller av PD som har geneUnder det senaste decenniet betat ökade ytterligare intresset för forskare för dopaminerga neuron kulturer. Här fokuserar video protokoll om den känsliga dissekering av embryonala mus hjärnor. Exakt excision av ventrala mesencephalon är avgörande för att få neuronala kulturer är tillräckligt rika på dopaminerga celler för att möjliggöra efterföljande studier. Detta protokoll kan realiseras med embryonala transgena möss och är lämplig för immunofluorescensfärgning, kvantitativ PCR, andra budbärare kvantifiering eller nervcellsdöd / överlevnadsbedömning.

Introduction

Dopamin, en av de viktigaste signalsubstanserna i hjärnan 1,2, huvudsakligen släpptes av mitthjärnan dopaminerga (DA) nervceller. Majoriteten av DA-neuroner bosatta i den ventrala delen av mesencephalon 2-6. Schematiskt kan mitthjärnan DA nervceller delas in i tre anatomiskt och funktionellt distinkta projektionssystem: mesostriatal, mesolimbiska och mesocortical vägar 2,5. Den nigrostriatala vägen är involverad i motorbeteende, de mesolimbiska vägar spelar en viktig roll i förstärkning, motivation och lärande, medan de dopaminerga vägar skjuter till prefrontala cortex är inblandade i kognition 2.

DA nervceller är inblandade i flera mänskliga neurologiska sjukdomar som schizofreni, uppmärksamhetsstörning, hyper aktivitetsstörning, och Parkinsons sjukdom (PD) 2,4. PD karakteriseras av en progressiv och selektiv degeneration av DA neuron ansluter substantia nigrapars compacta (SNC) till striatum. Förlusten av Nigro-striatala DA neuron i svår dopaminbrist i striatum som ansvarar för de motoriska symtomen vid PS (bradykinesi, vila tremor och rigiditet) 7. Den ursprungliga orsaken till idiopatisk PD har inte fastställts och de nuvarande behandlingar är endast symtomatisk, som syftar till att återställa dopaminnivån i striatum. Den mest förskrivna läkemedlet är L-Dopa (Levodopa), den naturliga föregångare till dopamin. Även administrering av Levodopa kompenserar för förlusten av dopamin under en viss tid, motoriska komplikationer uppstår efter långtidsbehandling (dyskinesi och on / off stater) 8,9.

Forskning om dopaminerga nervceller och PD är i ständig utveckling och intensiva ansträngningar görs för att utveckla behandlingar baserade på celltransplantation, genterapi, eller nervskyddande medel 10,11. Dock kvarstår en viktig fråga som inte klar: Vad är orsaken till den extrema vulnerabbilitet i DA nervceller? En del av svaret finns i aktiviteten av DA-neuroner. En minskning av den elektriska aktiviteten och retbarhet av DA neuron tycks öka deras benägenhet att urarta 12. Trots komplexiteten i PD patogenes kräver ytterligare studier för att identifiera de som är involverade i DA mekanismer nervceller degeneration 13-15.

Primära kulturer är särskilt relevant att studera DA neuron fastigheter 16-19 och utmana dessa neuroner till olika påfrestningar för utvärdering av neuroskyddande medel 20-24. Rat odlingsmodeller används oftast, eftersom dissekering av råttembryo mesencephalon är lättare, jämfört med musen, och större mängder av nervceller kan erhållas hos råtta. Men generation av transgena musmodeller av sjukdomen 25 har betydligt ökat intresse hjärnforskare community för primära kulturer från musen 26-29. Fastän kulturer prepared från nyfödda djur kan användas, är det bättre att förbereda dem från embryon vid post-mitotiska stadiet (E13.5 för mesencephalon neuroner), när nervceller har behållit sin förmåga att differentiera. Följande protokoll består av isolerade mesencephalon nervceller i primär kultur från musembryon (E13.5), som är den svåraste att förbereda. Notably, tillhandahåller vi ett protokoll med användning av serumfritt odlingsmedium för en bättre reproducerbarhet. De två mest kritiska stegen i förberedelserna kultur (dissekering och mekanisk dissociation) kommer att noggrant beskrivs i den tillhörande videon.

Protocol

De möss som användes i detta arbete var omhändertagna och hanteras i enlighet med riktlinjerna från Europeiska unionens råd (86/609 / EU) för användning av försöksdjur. 1 Beredning av Nödvändiga lösningar Stamlösningar 10x Poly-L-ornitin (PLO) Lösning: Väg in 10 mg PLO hydrobromid (molekylvikt = 30,000-70,000) och lös upp i 70 ml sterilt vatten. Filtrera lösningen genom att använda 0,2 | im sprutfilter, alikvot, och förvara vid -20 ° C. 30% g…

Representative Results

En illustrerad flödesschema över mesencefalon odlingssteg visas i figur 1. Kortfattat, efter insamling E13.5 embryon från en gravid schweizisk mus, är ventrala mitthjärnan dissekerades från hela embryot. De isolerade hjärnfragment successivt fram för enzymatisk nedbrytning och mekanisk dissociation. Dissocierade celler pelleteras genom centrifugering, resuspenderades i odlingsmedium och ströks ut i förbelagda 12 eller 24-brunnars plattor. Celler bibehålls upp till 15 dagar utan mellan ersätt…

Discussion

Detta protokoll presenteras de förfaranden och reagens som är nödvändiga för att förbereda en primärkultur mesencefala nervceller från embryonala musen och immunofluorescens förfarandet för att upptäcka dopaminerga neuroner. Kritiska steg i proceduren är dissektion av embryon och mekaniska dissociation av de insamlade hjärnfragment. Hög dissektion instrument kvalitet hjälper till att behärska dissektion tekniken. DA nervceller utgör en liten del av mitthjärnan. Således samla den högra delen av den ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Materials

Fetal Bovine Serum Lonza 14-801F
DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine Lonza BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red  Life Technologies 25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
L-glutamine, 200 mM Solution Life Technologies 25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich  D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich  D0547 Powder
Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl Sigma-Aldrich  L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich  P3655
Insulin from porcine pancreas Sigma-Aldrich  I5523
apo-Transferrin human Sigma-Aldrich  T1147
Putrescine dihydrochloride Sigma-Aldrich  P5780
Progesterone Sigma-Aldrich  P8783
Sodium selenite Sigma-Aldrich  S5261
HEPES Sigma-Aldrich  H4034 
Glycine Sigma-Aldrich  G7126 Stock solution 1M in water
Gelatin Sigma-Aldrich  G9391 Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T8532
Paraformaldehyde 16% in water Electron Microscopy Sciences RT 15710-S
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Merck Millipore 106329
D(+)-Glucose, Monohydrate Merck Millipore 4074-2
Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur Merck Millipore 109057
Sterile water – Aqua B. Braun Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent VWR 20821.321
Sterile Petri Dishes VWR 82050-566
Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. VWR 612-2297
Counting chamber Malassez VWR 631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm PALL Life science 4525
Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long Fine Science Tools 14002-14 To open the abdominal wall
Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long MORIA 4877A To open the uterine wall
Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm MORIA 2183 To manipulate embryos
Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades MORIA MC50 To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long MORIA 9987 To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates BD Bioscience 356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid BD Bioscience 353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º MENZEL-GLÄSER AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø MARIENFELD 117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody Chemicon Millipore AB5622 1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 Chemicon Millipore MAB5406 1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt  Chemicon Millipore MAB369 1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin Life Technologies 16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-31556 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11001 1/1000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11007 1/1000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium Vector Laboratories H-1400
Stereomicroscope Carl Zeiss microscopy Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY VWR 451-0136

References

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
check_url/51751?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Gaven, F., Marin, P., Claeysen, S. Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51751, doi:10.3791/51751 (2014).

View Video