Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo<em> Salmonella enterica</em> Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos
Summary
Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.
Abstract
Especies de Salmonella son patógenos zoonóticos y principales causas de las enfermedades transmitidas por los alimentos en los seres humanos y el ganado 1. La comprensión de los mecanismos que subyacen a las interacciones Salmonella -host son importantes para dilucidar la patogénesis molecular de la infección por Salmonella. El ensayo de protección de Gentamicina fenotipo asociación Salmonella, la invasión y la replicación en las células fagocíticas fue adaptado para permitir la selección de alto rendimiento para definir las funciones de los mutantes de deleción de Salmonella enterica serotipo Typhimurium en las interacciones huésped utilizando RAW 264,7 macrófagos murinos. Bajo este protocolo, la varianza en las mediciones se reduce significativamente en comparación con el protocolo estándar, porque de tipo salvaje y cepas mutantes múltiples pueden ser probados en la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo. El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento y mejora la precisión. Además, las preocupaciones relacionadas con el uso de menos hose trataron células st por pocillo en 96-así placa de cultivo. En este caso, el protocolo de la vitro Salmonella ensayo modificado en la invasión utilizando células fagocíticas se empleó con éxito al fenotipo 38 mutantes de deleción Salmonella individuales para la asociación, la invasión y la replicación intracelular. Se presentan los fenotipos in vitro, algunos de los cuales fueron posteriormente confirmó que en fenotipos in vivo en un modelo animal. Por lo tanto, la modificación, ensayo estandarizado fenotipo Salmonella asociación, la invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento podría ser utilizado más ampliamente para estudiar las interacciones huésped-bacteriana.
Introduction
No tifoidea Salmonella son causas importantes de enfermedades entéricas en todos los vertebrados. La salmonelosis en los seres humanos es una de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos bacterianas 1. Caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones de Salmonella con sus huéspedes animales se logra principalmente a través del estudio de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (STM) en cultivo de tejidos y modelos animales de infección. Obtener ideas en las interacciones huésped-STM nos ayudará a entender cómo Salmonella sobrevivir y crecer dentro de las células huésped. El primer reto en el estudio de estas interacciones es identificar el mayor número de factores que participan como sea posible, tanto huésped y el patógeno, pero estos esfuerzos estén obstruidas en gran medida por las dificultades significativas de tratar con dos sistemas biológicos complejos independientes de forma simultánea, es decir, de acogida y Salmonella, en condiciones fisiológicas. Además, la gran RepertOire de Salmonella y genes de acogida factores que intervienen en las interacciones huésped potencialmente codifican requieren plataforma biológica de alto rendimiento para hacer frente a este desafío.
A modificada, ensayo estandarizado fenotipo asociación Salmonella, invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento fue desarrollado para examinar un gran conjunto de genes que participan en las interacciones probables de Salmonella -host. El ensayo de protección de gentamicina fue desarrollado en 1973 2, pero fue el primero en describir minuciosamente por Elsinghorst en 1994 3,4. Ahora se ha convertido en una herramienta estándar para el estudio de muchos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluyendo Salmonella 5,6. Bacterias internalizadas evitar ser asesinados por algunos antibióticos, tales como gentamicina, que no pueden penetrar las células eucariotas 3. Al tomar ventaja de este fenómeno, el ensayo de protección de gentamicina mide la supervivencia y crecimiento de ba intracelularpatógenos cterial. Tres eventos durante la infección, es decir, la asociación con las células eucariotas, la invasión y la replicación, pueden ser evaluadas para los patógenos bacterianos intracelulares basados en el intervalo de tiempo entre la infección, el tratamiento de gentamicina, e incubación adicional (Figura 1). Líneas celulares eucariotas proporcionan un entorno fisiológico que es menos complejo que los modelos animales relevantes para los estudios de interacción huésped-patógeno.
El ensayo de protección de gentamicina es una plataforma adecuada para estudiar las interacciones STM-anfitrión, pero el ensayo estándar en una placa de cultivo de 24 pocillos tiene baja capacidad de rendimiento. Análisis computacional de los conjuntos de datos in vivo identificó 149 productos génicos Salmonella que se predicen para interactuar con aproximadamente 300 productos de los genes de acogida (datos no publicados). El ensayo de protección estándar Gentamicina no tiene la capacidad de fenotipo este número de mutantes de manera eficiente.
En addition, el ensayo de protección de gentamicina puede detectar teóricamente la invasión de incluso una sola bacteria. Debido a esta sensibilidad inherente, los datos en bruto son susceptibles a las variaciones técnicas cuando se repite en diferentes momentos. Los controles internos y la presentación de los datos en relación después de la normalización son esenciales para la interpretación significativa de los resultados. Dadas estas consideraciones, un ensayo de protección de gentamicina normalizado modificado fue desarrollado para mejorar la capacidad de prueba y aumentar la precisión.
El siguiente protocolo es detallada e ilustrada para llevar a cabo el ensayo de protección de gentamicina modificado utilizando 96 pocillos y placas de cultivo de la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7. En comparación con el protocolo estándar de 24 pocillos placas de cultivo, el protocolo modificado tiene las siguientes ventajas: 1) El uso de 96 pozos placas de cultivo permite hasta 10 diferentes cepas mutantes que fenotipados incluidos los controles positivos y negativos internos con suficiente poder estadístico;2) La varianza de los resultados se reduce significativamente, porque las cepas mutantes se ensayaron de la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo; 3) El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador. Por último, en comparación con 24 y placas de cultivo, las preocupaciones de menos células huésped por pocillo en 96-así placa de cultivo se abordaron a través de la optimización del protocolo y la normalización.
En resumen, el modificado, ensayo estandarizado para Salmonella in vitro fenotipo u otra asociación bacteriana, la invasión y la replicación en las células fagocíticas aumenta la precisión y logra la capacidad de alto rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de protección de gentamicina se utiliza ampliamente para estudiar la invasión y la replicación de patógenos bacterianos intracelulares dentro de la célula huésped, y es especialmente una herramienta biológica importante para el estudio de los patógenos, como Salmonella, cuya invasión es el paso requisito previo para el establecimiento de la infección 1. El ensayo estándar de protección de gentamicina en la comunidad de investigación de Salmonella se implementa en 24 po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud NIAID (por AJB y LGA, R01 AI076246). La colección mutante de Salmonella fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 y R01 AI075093-01), en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Damos las gracias a Steffen Prowollik de réplica en placa y confirmando los mutantes de la colección.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
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