High-throughput Assay om Phenotype<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen
Summary
Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.
Abstract
Salmonella species zijn zoönotische pathogenen en de belangrijkste oorzaken van door voedsel overgedragen ziekten bij mens en vee 1. Inzicht in de onderliggende mechanismen Salmonella -host interacties zijn belangrijk om de moleculaire pathogenese van Salmonella infectie helderen. De Gentamicine bescherming test om Salmonella vereniging, invasie en replicatie fenotype in fagocytcellen werd aangepast om high-throughput screening om de rollen van deletiemutanten van Salmonella enterica serotype Typhimurium in gastheer interacties met behulp van RAW 264,7 muizenmacrofagen definiëren. Hoofde van dit Protocol, de variantie in de metingen is aanzienlijk korter dan het standaard protocol, omdat de wild-type en mutante stammen multiple kunnen worden getest in dezelfde kweekschaal en tegelijkertijd. Het gebruik van multichannel pipetten verhoogt de doorvoer en verhoogt precisie. Bovendien, bezorgdheid over het gebruik van minder host cellen per putje in 96-putjes schaal waren gericht. Hier werd het protocol van de in vitro gemodificeerd Salmonella invasie assay met fagocytische cellen met succes toegepast om 38 afzonderlijke Salmonella deletiemutanten voor associatie, invasie en intracellulaire replicatie fenotype. De in vitro fenotypes worden, waarvan sommige later bevestigd om in vivo fenotypes in een diermodel. Aldus, de gemodificeerde, gestandaardiseerde test Salmonella vereniging invasie en replicatie in macrofagen met een hoge verwerkingscapaciteit kunnen breder worden gebruikt om bacteriële gastheer interacties te bestuderen fenotype.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella belangrijke oorzaken van enterische ziekte in alle vertebraten. Salmonellose bij de mens behoort tot de top bacteriële voedsel overgedragen ziekten 1. Karakterisering van de moleculaire mechanismen die de interacties van Salmonella onderbouwen met hun dierlijke gastheren wordt vooral bereikt door de studie van Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) in weefselkweek en diermodellen van infectie. Verkrijgen van inzicht in STM-gastheer interacties zal ons helpen begrijpen hoe Salmonella overleven en te groeien in gastheercellen. De eerste uitdaging in het bestuderen van deze interacties is om zoveel mogelijk deelnemende factoren identificeren van zowel de gastheer en pathogeen, maar deze pogingen zijn grotendeels geblokkeerd door de grote problemen van het omgaan met twee onafhankelijke complexe biologische systemen tegelijk, namelijk talrijke en Salmonella, onder fysiologische omstandigheden. Daarnaast is de grote repertOire van Salmonella en gastheer genen potentieel coderen factoren betrokken bij gastheer interacties vereisen high-throughput biologische platform om deze uitdaging aan te pakken.
Gemodificeerd gestandaardiseerde test Salmonella vereniging invasie en replicatie in macrofagen met hoge verwerkingscapaciteit fenotype werd ontwikkeld om een groot aantal genen waarschijnlijk betrokken zijn in Salmonella -host interacties onderzocht. De Gentamicine bescherming assay werd ontwikkeld in 1973 2 en voor het eerst grondig beschreven door Elsinghorst in 1994 3,4. Het is nu uitgegroeid tot een standaard tool voor het bestuderen van vele intracellulaire bacteriële pathogenen ex vivo, waaronder Salmonella 5,6. Geïnternaliseerde bacteriën voorkomen worden gedood door sommige antibiotica, zoals Gentamicine, dat eukaryote cellen 3 niet kan doordringen. Door gebruik te maken van dit verschijnsel, de gentamicine bescherming assay meet de overleving en groei van intracellulaire bacterial pathogenen. Drie gebeurtenissen tijdens de infectie, dat wil zeggen samen met eukaryote cellen, invasie en replicatie kan worden geëvalueerd voor intracellulaire bacteriële pathogenen op basis van het tijdsinterval tussen infectie Gentamicine behandeling en verdere incubatie (Figuur 1). Eukaryote cel lijnen zorgen voor een fysiologische omgeving, dat is minder complex dan relevante diermodellen voor gastheer-pathogeen interactie studies.
De Gentamicine bescherming test is een geschikt platform om STM-gastheer interacties te bestuderen, maar de standaard test in een 24-well cultuur schotel heeft een lage doorvoercapaciteit. Computationele analyse van in vivo datasets geïdentificeerd 149 Salmonella genproducten die worden voorspeld om te interageren met ongeveer 300 gastheer genproducten (ongepubliceerde gegevens). De standaard Gentamicine bescherming assay niet de capaciteit van aantal mutanten efficiënt fenotype.
In addition, kan het Gentamicin bescherming test theoretisch detecteren de invasie van zelfs een enkele bacterie. Vanwege deze inherente gevoeligheid, de ruwe gegevens zijn gevoelig voor technische variaties bij herhaald op verschillende tijdstippen. De interne controles en relatieve data presentatie na normalisatie zijn essentieel voor een zinvolle interpretatie van de resultaten. Gezien deze overwegingen werd een gemodificeerde, gestandaardiseerde Gentamicin bescherming test ontwikkeld om het testen van de capaciteit te verbeteren en verhogen de precisie.
Het volgende protocol is gedetailleerd en geïllustreerd om de gewijzigde Gentamicine bescherming assay met 96 putjes en het murine macrofaag cellijn RAW264.7 voeren. Vergeleken met het standaard protocol in 24-putjes, het gemodificeerde protocol heeft de volgende voordelen: 1) met 96 putjes kunnen tot 10 verschillende mutante stammen worden fenotype inclusief interne positieve en negatieve controles met voldoende statistische power;2) De variantie van de resultaten wordt aanzienlijk verminderd, omdat de mutante stammen worden getest in dezelfde kweekschaal en tegelijkertijd; 3) Het gebruik van meerkanaalspipetten verhoogt de doorvoersnelheid terwijl het verminderen van de vermoeidheid. Tenslotte, in vergelijking met 24-putjes werden zorgen van minder ontvangende cellen per putje in 96-putjes schaal aangepakt door protocol optimalisatie en standaardisatie.
Samengevat, de gemodificeerde, gestandaardiseerde assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen verhoogt de precisie en bereikt high-throughput capaciteit en het verminderen vermoeidheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Gentamicine bescherming assay wordt wijd gebruikt om de invasie en replicatie van intracellulaire bacteriële pathogenen binnen gastheercel bestuderen, en het is bijzonder belangrijk biologisch hulpmiddel om pathogenen zoals Salmonella, waarvan invasie de vereiste stap voor het vaststellen infectie 1. De standaard Gentamicine bescherming assay in Salmonella onderzoeksgemeenschap wordt uitgevoerd in 24-well cultuur schotel 5. Hoewel het gebruik van 48 of 96-well platen voor besp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd mede ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health NIAID (voor AJB en LGA, R01 AI076246). De Salmonella mutant collectie werd mede ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie (voor MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 en R01 AI039557-11 AI075093-01), deels door de National Institutes of Health-subsidie (voor HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wij danken Steffen Prowollik voor replica plating en bevestiging van de mutanten in de collectie.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
