De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos
Summary
Um ensaio de elevado débito para a Salmonella in vitro o fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas, com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido. O método foi empregado para avaliar knockout gene Salmonella cepas mutantes de seus envolvimentos na interação patógeno-hospedeiro.
Abstract
Espécies de Salmonella são patógenos zoonóticos e principais causas de doenças de origem alimentar em humanos e animais domésticos 1. A compreensão dos mecanismos subjacentes às interacções Salmonella -host são importantes para elucidar a patogênese molecular da infecção por Salmonella. O ensaio de proteção gentamicina para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em células fagocíticas foi adaptado para permitir a seleção de alto rendimento para definir os papéis dos mutantes de deleção de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium em interações de host utilizando matérias 264,7 macrófagos murinos. Sob este protocolo, a variância em medições é significativamente reduzida em comparação com o protocolo padrão, porque o tipo selvagem e estirpes mutantes múltiplas pode ser testado no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo. O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade e melhora a precisão. Além disso, as preocupações relacionadas com a utilização de menos host células por cavidade em 96 cavidades de cultura prato foram abordados. Aqui, o protocolo do ensaio modificado in vitro a invasão de Salmonella usando células fagocíticas foi empregue com sucesso para o fenótipo 38 individuais de Salmonella mutantes de deleção de associação, invasão e replicação intracelular. Os fenótipos in vitro são apresentados, alguns dos quais foram posteriormente confirmadas ter em fenotipos in vivo num modelo animal. Assim, a modificação, o ensaio padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento poderia ser utilizada de forma mais ampla para estudar as interações de bactérias hospedeiras.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella são importantes causas de doenças entéricas em todos os vertebrados. A salmonelose em humanos está entre as principais doenças de origem alimentar bacteriana 1. Caracterização dos mecanismos moleculares que estão na base das interações de Salmonella com seus hospedeiros animais é alcançada principalmente através do estudo da Salmonella Typhimurium enterica sorotipo (STM) em modelos de cultura de tecidos e animais de infecção. Busca de insights nas interações STM-hospedeiro nos ajudará a entender como Salmonella sobreviver e crescer dentro das células hospedeiras. O primeiro desafio em estudar essas interações é identificar o maior número de fatores de participantes possível, tanto acolhimento e patógeno, mas estes esforços são em grande parte obstruída pelas dificuldades significativas de lidar com dois sistemas biológicos complexos independentes simultaneamente, ou seja, de acolhimento e de Salmonella, sob condições fisiológicas. Além disso, o grande Repertoirê de Salmonella e genes do hospedeiro potencialmente fatores envolvidos na interação hospedeiro codificam exigem alto throughput plataforma biológica para enfrentar este desafio.
A modificação, teste padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido para examinar um grande conjunto de genes provavelmente envolvidos em interações Salmonella -host. O ensaio de protecção de gentamicina foi desenvolvido em 1973 2, mas foi completamente descrita em primeiro lugar, em 1994 por Elsinghorst 3,4. Ela tornou-se uma ferramenta padrão para o estudo de muitos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluindo Salmonella 5,6. Bactérias internalizadas evitar ser morto por alguns antibióticos, como a gentamicina, que não podem penetrar as células eucarióticas 3. Tirando proveito desse fenômeno, o ensaio de proteção gentamicina mede a sobrevivência eo crescimento das ba intracelularpatógenos cterial. Três eventos durante a infecção, por exemplo, a associação com células eucarióticas, invasão e replicação, pode ser avaliada por agentes patogénicos bacterianos intracelulares, com base no intervalo de tempo entre a infecção, o tratamento de gentamicina, e após incubação (Figura 1). Linhagens de células eucarióticas proporcionar um ambiente fisiológico que é menos complexo do que os modelos animais relevantes para estudos de interação patógeno-hospedeiro.
O ensaio de proteção gentamicina é uma plataforma adequada para estudar as interações STM-hospedeiro, mas o ensaio padrão de 24 poços cultura prato tem capacidade baixa taxa de transferência. Análise computacional de conjuntos de dados in vivo identificou 149 produtos de genes Salmonella que estão previstos para interagir com cerca de 300 produtos de genes de acolhimento (dados não publicados). O ensaio de protecção de gentamicina padrão não tem a capacidade de fenótipo este número de mutantes de forma eficiente.
Em additião, o ensaio de protecção de gentamicina pode teoricamente detectar a invasão de mesmo uma única bactéria. Devido a esta sensibilidade inerente, os dados em bruto são susceptíveis a variações técnicas quando repetido em diferentes momentos. Os controles internos e de apresentação dos dados relativos após a normalização são essenciais para a interpretação significativa dos resultados. Dadas estas considerações, um ensaio de proteção gentamicina padronizado modificado foi desenvolvido para aumentar a capacidade de teste e aumentar a precisão.
O protocolo seguinte é pormenorizada e ilustrada de realizar o ensaio de protecção de gentamicina modificada de 96 poços utilizando placas de cultura e a linha celular RAW264.7 de macrófagos de murino. Comparado com o protocolo padrão em pratos de 24 poços de cultura, o protocolo modificado tem as seguintes vantagens: 1) Utilização de 96 poços de cultura de placas permite que até 10 estirpes mutantes diferentes para ser fenotipados incluindo os controlos positivos e negativos internos, com potência estatística suficiente;2) A variância dos resultados é significativamente reduzida, porque as estirpes mutantes são testados no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo; 3) O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade enquanto reduz a fadiga do operador. Por último, em comparação com 24 poços placas de cultura, as preocupações de menos células hospedeiras por poço em 96 poços prato de cultura foram abordadas através de otimização de protocolos e padronização.
Em resumo, a modificação, o ensaio in vitro padronizado para Salmonella fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas aumenta a precisão e alcança a capacidade de elevado rendimento, reduzindo a fadiga do operador.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de protecção de gentamicina é amplamente utilizado para estudar a invasão e replicação de agentes patogénicos bacterianos intracelulares dentro da célula hospedeira, e é especialmente uma ferramenta importante para o estudo de organismos patogénicos biológico, como a Salmonella, cuja invasão é o passo de pré-requisito para o estabelecimento de infecção de 1. O ensaio padrão de proteção gentamicina na comunidade de pesquisa Salmonella é implementado em 24 bem plac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi apoiado em parte por uma doação para os Institutos Nacionais de Saúde NIAID (para AJB e LGA, R01 AI076246). A coleção mutante Salmonella foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (para MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), em parte pelo National Institutes of Health (para HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Agradecemos Steffen Prowollik para réplica de placas e confirmando os mutantes na coleção.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
