JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Modeling astrocytom Patogenese<em> In Vitro</em> Og<em> In Vivo</em> Brug Kortikal Astrocyter eller neurale stamceller fra Betinget, gensplejset Mus

Published: August 12, 2014
doi:
10.3791/51763
, , , , , , , ,
1Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center,University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology,University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program,University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology,Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center,University of North Carolina School of Medicine

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrocytomer er den mest almindelige primær hjernesvulst og glioblastom (GBM), en grad IV astrocytoma, er den mest almindelige og aggressiv undertype med en median overlevelse på 12-15 måneder 1,2. Invasion af diffuse astrocytomer, især GBM, er til hinder for komplet kirurgisk resektion, begrænser effektiviteten af adjuverende behandlinger, og uundgåeligt fører til efterbehandling gentagelse 3. Patienter oprindeligt til stede enten med de novo (primære) GBM eller med lavere lønklasse astrocytomer der uundgåeligt udvikler sig til (sekundær) GBM 4. GBM er genomisk heterogen og præget af gensidigt udelukkende og co forekommende mutationer i gener, der styrer tre centrale signalveje: G 1 / S (RB) cellecyklus checkpoint, receptor (RTK) og TP53 veje 5-7. GBM består af fire genomiske undertyper med særskilte udtryk profiler, der ligner forskellige hjerne celletyper, hvilket tyder på, at GBM subtype Influket af sin celle af oprindelse 6,8,9. Bedre astrocytom modeller er forpligtet til at definere den rolle, specifikke kombinationer af mutationer i bestemte celletyper under astrocytom patogenese. Udnyttelse af disse modeller for en mere effektiv præklinisk udvikling lægemiddel vil i sidste ende bidrage til at forbedre patienternes resultater. Aktuelle astrocytom modeller omfatter etablerede humane cellelinjer, patient afledt xenografter (PDX), genetisk modificerede normale humane astrocytter og neurale stamceller (NSC), og genetisk modificerede mus (GEM) 10-14. Vi udviklede et alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) model 15 udnytte primære hjerneceller – kortikale astrocytter og NSC – høstet fra GEM huser forskellige kombinationer af floxet onkogene alleler. Målet var at skabe astrocytom modeller med genetisk definerede celler, der kan fænotypisk karakteriseret både in vitro og in vivo og potentielt udnyttes til præklinisk udvikling af lægemidler i jegmmune-kompetente mus.

Etablerede humane cellelinjer er de mest almindeligt anvendte model af astrocytoma patogenese og lægemiddelrespons in vitro og in vivo. De er teknisk set ligetil, bredt tilgængelige, og har defineret kinetik og tumorigenicitet upon orthotopisk xenografting i immunsvækkede mus 10,11,16-18 . Deres ulemper indbefatter den manglende evne til at generere etablerede cellelinjer fra lav kvalitet astrocytomer, begrænser undersøgelsen kun high-grade astrocytomer; Manglen på en defineret celle oprindelse; tilstedeværelsen af ​​komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomiske profiler, som afviger markant fra den oprindelige patientprøve; og modtagelighed for fænotypiske og genotypiske respons må i løbet seriel kultur i serum 11,17,19-22. De fænotypiske konsekvenser af de enkelte onkogene mutationer i etablerede humane GBM cellelinjer kan maskeres ved de mange abnormiteter, der faktisk er til stede, hvilket ofte er til hinder elucsering af direkte genotype-fænotype konsekvenser.

PDX genereres gennem subkutan passage af patient-isolerede astrocytomceller i immunsvækkede mus eller gennem deres kultur som ikke-klæbende sphæroider i defineret, serum-frit medium forud for orthotopisk injektion i hjernerne hos immunsvækkede mus 12,23. PDX mere præcist opretholde genomisk landskab af menneskelige astrocytomer, men magen til etablerede humane cellelinjer, kan den fænotypiske effekt af de enkelte onkogene mutationer være maskeret på grund af deres genomiske kompleksitet 19,24. At definere de fænotypiske konsekvenser af specifikke onkogene mutationer, især som reaktion på nye behandlingsformer, er paneler af etablerede humane cellelinjer eller PDX ofte udnyttes til at etablere genotype-fænotype korrelationer viser generaliserbarhed, og minimere sandsynligheden for cellelinje-specifikke effekter. Mens PDX nøjagtigt rekapitulere de histopatologiske kendetegnende for menneskelig astrocytomer, including invasion, ortotopisk xenotransplantater af etablerede humane cellelinjer generelt ikke 21,23,25. Derudover normale humane astrocytter og NSC er blevet genetisk manipuleret med definerede onkogene mutationer at modellere astrocytom tumorigenese in vitro og in vivo 13,14,26. Disse celler mangler det genomiske kompleksitet etablerede humane cellelinjer og PDX og præcist rekapitulere menneskelige astrocytom histopatologi, men kræver xenografting i immunsvækkede gnavere in vivo. Fordi alle menneskelige celle modeller kræver immundefekte gnaver værter til at forhindre immunmedieret xenotransplantatafstødning, disse modeller undlader at rekapitulere de native tumor-stroma interaktioner af et syngen system, og mangler et intakt immunsystem, begrænsning præklinisk undersøgelse af stroma-målrettet og immun-modulerende terapier 10,11.

GEM tillader undersøgelse af fænotypiske konsekvenser af forudbestemte kombinationer af onkogene mutationer in vivo under in situ tumorigenese. Mens ikke-betinget GEM har mutationer i alle væv i hele udvikling, har betinget GEM floxet onkogene alleler, der muliggør målretning af mutationer ved at begrænse Cre-medieret rekombination til specifikke celletyper ved anvendelse af celletype-specifikke promotorer 10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM er blevet anvendt til at belyse de funktionelle roller onkogene mutationer i forskellige celletyper i en intakt hjerne 11. Den prækliniske nytte af in situ gliomagenesis brug af betinget GEM er begrænset af en række faktorer, herunder 1) manglen på en in vitro-korrelat, 2) svært ved at generere store grupper af mus med komplekse genotyper, 3) lang latenstid in situ tumor udvikling , 4) og stokastisk tumorprogression. Fordi in situ tumorgenese mangler en tilsvarende in vitro-model, kan narkotika-test in vitro ikke udføres wed konventionelle betingede GEM modeller. I modsætning til andre kræftformer, er betingede GEM modeller af astrocytomer sjældent fremkaldt af enkelte onkogene mutationer 11. Således er komplekse avlsplaner skal generere betinget PERLE med flere onkogene mutationer. Desuden forekommer astrocytoma initiering med variabel penetrans efter en lang latensperiode i disse modeller, mens progression til high-grade astrocytomer generelt sker i en ikke-ensartet, stokastisk måde og i sidste ende giver anledning til tumorer med komplekse genomiske landskaber og hurtige vækstkinetik 27, 28. Den variable penetrans og stokastiske natur malign progression i betingede GEM-modeller kræver, at de enkelte mus screenes ved radiografisk billeddannelse til at detektere tilstedeværelsen og placeringen af ​​high-grade astrocytomer før deres indskrivning i prækliniske lægemiddelforsøg. Tilsammen disse begrænsninger hindrer generering og test af de store kohorter af betinget GEM kræves for PReClinical narkotika testning.

Den RCAS-TVA GEM system, som udnytter aviær retrovirale (RCAS) vektorer at inficere GEM manipuleret til at udtrykke den virale receptor (TVA) på specifikke neurale celletyper, er blevet ekstensivt anvendt til at modellere astrocytom tumorigenese 11. I modsætning til betinget GEM dette modelsystem, gør indførelsen af ​​flere onkogene mutationer i specifikke celletyper uden behov for komplekse avlsplaner. Det er imidlertid begrænset af variabel penetrans, kravet om aktivt delende celler for at opnå viral integration, og tilfældig indsættelse af transgener i værtsgenomet 29.

Ikke-kimlinie GEM (nGEM) modeller, der anvender celler høstes fra GEM, bliver mere og mere vigtige, fordi de overvinde mange af de begrænsninger af andre modelsystemer 15. Rolle indlede celletype og co forekommende mutationer i astrocytoma patogenese er vanskelige at afskrækkeminen ved anvendelse af etablerede humane GBM cellelinjer eller PDX, fordi de stammer fra slutstadiet tumorer, der har akkumuleret omfattende genetiske mutationer i udefinerede celletyper i løbet af malign progression. I modsætning hertil kan alle kvaliteter af astrocytomer modelleres ved hjælp nGEM ved at inducere definerede genetiske mutationer inden for specifikke oprensede hjerne celletyper 11,30. Således kan bestemmes indflydelsen af specifikke genetiske mutationer og celletype på cellulære og molekylære fænotyper in vitro og in vivo. Svarende til etablerede humane GBM-cellelinjer kan indledende in vitro test af lægemidler i at bruge nGEM anvendes til at prioritere lægemidler til in vivo-test, der anvender de samme celler. Tumorigenese in vivo kan derefter bestemmes ved allografting nGEM celler orthotopisk i hjernen på immun-kompetente syngene kuld 30. Disse ortotopisk allotransplantat modellerne tillader derfor in vivo-test ikke kun af konventionel cytotoksisk ennd målrettede behandlinger, men immun-modulerende og stroma målrettede behandlinger så godt. Endelig kan rolle mikromiljøet på tumorinitiering og progression bestemmes ved at sammenligne resultaterne mellem nGEM og konventionelle GEM modeller under anvendelse af de samme mutationer i de samme celletyper.

Vi og andre har udviklet astrocytoma nGEM med primære celler – astrocytter, NSC eller oligodendrocyt prækursorceller (OPC) – høstet fra GEM 30-34. Rationalet bag udviklingen af en astrocytoma nGEM var at skabe en model til at bestemme de fænotypiske konsekvenser af onkogene mutationer i specifikke celletyper, der potentielt kan bruges til præklinisk test af lægemidler in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstede fænotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre udtrykker, betinget GEM vedligeholdes på en> 94% C57 / BL6 baggrund med floxet RB vej – RB1 loxP / loxP eller TgGZT121 – og floxet RTK / RAS / PI3K vej – NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – generne i forskellige kombinationer 35-39. Vi induceret genetisk rekombination in vitro ved anvendelse adenovirale vektorer, der koder Cre-rekombinase. Fordi kortikale astrocyt høst indeholder en blanding af celletyper, vi anvendte Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, såsom TgGZT 121 drevet fra den humane GFAP promotor, at berige for GFAP + corticale astrocytter i disse kulturer. Vi definerede fænotypiske konsekvenser af G 1 / S (Rb), MAPK, og PI3K pathway mutationer i corticale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K-forløb-aktiveret G1 / S-defekte astrocytter molekylært efterlignede menneskelige proneural GBM og efter orthotopisk injektion, dannet tumorer i en foruddefineret placering med ensartede vækstkinetik, korte latenstider og histopatologiskeal kendetegnende for human GBM 30. Longitudinal overvågning af tumorvækst in vivo hjælpemidler præklinisk stof gennem normalisering af behandlingsmuligheder kohorter og kvantitativ analyse af tumorvækst i respons på behandlingen 40. Vi fast tumor vækstkinetik af langsgående bioluminescens billeddannelse af mus injiceret med luciferase udtrykke corticale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC afledt betinget PERLE give en medgørlig model system til definition af funktionelle konsekvenser af astrocytom-associerede mutationer og en mulig model for præklinisk lægemiddeludvikling.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of North Carolina Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1. Dyrkningen kortikal Astrocyter fra neonatale mus Forberedelse Krølle 2-3 vanskelige opgave væv og anbringes i bunden af ​​en kolbe indeholdende 70% ethanol. Placer dissekere saks, buede pincet og 2 par lige mikro pincet i denne kolbe. Vævene anvendes for at undgå bøjning mikro pincet. Tilsæt 1 ml HBSS til en 60 mm vævskulturskål. Forbered en se…

Representative Results

Vi udviklede et nGEM modelsystem med corticale astrocytter og NSC høstet fra neonatal GEM skjult floxet betingede onkogene alleler, der kan fænotypisk karakteriseret in vitro og in vivo (figur 1). For at undersøge konsekvenserne af onkogene mutationer specifikt i kortikale astrocytter in vitro, er det vigtigt først at berige for astrocytter. Kortikale astrocyt høst indeholder en blanding af mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter, OPC, og neuroner, men mekaniske og genetiske met…

Discussion

De mest kritiske trin for at sikre korrekt høst og dyrkning af corticale astrocytter er 1) at udskære cortex uden at væv under corpus callosum, 2) at fjerne meninges, 3) til grundigt at adskille celler, og 4) for at berige for GFAP + astrocytter. Selvom vi brugte mekanisk (rysten) og genetiske (begrænsning af genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller udnyttelse af en dominerende transformerende transgen (TgGZT 121) under GFAP promotor kontrol) metoder til at berige…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml tubes BD Biosciences 352096
50 ml tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 ga needles  Fisher Scientific NC9015638 
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
 Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

AstrocytomaGlioblastomaCortical AstrocytesNeural Stem CellsConditional Genetically Engineered MiceOncogenic MutationsTumor Suppressor GenesIn Vitro TransformationOrthotopic AllograftsBioluminescence ImagingPreclinical Drug Development
check_url/51763?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image