모델링 성상 세포종 병인<em> 체외</em>와<em> 생체</em> 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
성상 세포종은 가장 흔한 일차 뇌종양 및 아교 모세포종 (GBM), 등급 IV의 성상 세포종 아르, 12-15개월 1,2의 평균 생존과 가장 일반적이고 공격적인 서브 타입이다. 미만성 성상 세포종, 특히 GBM의 침공, 완전한 수술 적 절제를 배제 보조 요법의 효과를 제한하고, 필연적으로 치료 후 재발 세 리드. 드 노보 (주) GBM 또는 필연적으로 (보조) GBM 사에 진행 낮은 뇌 성상 세포종 중 처음 본 환자. GBM은 유 전적으로 이기종 세 가지 핵심 신호 전달 경로 제어하는 유전자에 상호 배타적와 공동으로 발생하는 돌연변이에 의해 특징입니다 : G 1 / S (굽은) 세포주기 체크 포인트, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를, 그리고 TP53 5-7 경로. GBM은 GBM의 하위 유형 influ 것을 제안, 서로 다른 뇌 세포 유형과 유사한 별개의 발현 양상과 네 게놈 하위 유형으로 구성원점 6,8,9의 그것의 세포에 의해 추측되는. 성상 세포종 나은 모델은 성상 세포종 병인 중에 특정 세포 유형의 돌연변이의 특정 조합의 역할을 정의해야한다. 보다 효율적인 임상 약물 개발을위한 이러한 모델을 활용하여 궁극적으로 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다. 성상 세포종 전류 모델은 인간 세포주, 환자 유래의 이종 이식 (PDX), 유전자 변형 정상적인 인간 성상 세포와 신경줄 기세포 (NSC), 유전자 조작 및 마우스 (GEM) 10-14 확립 포함한다. 대뇌 피질의 성상 및 NSC – – floxed 종양 대립 유전자의 다양한 조합을 품고 GEM에서 수확 우리는 차 뇌 세포를 활용 대안, 비 생식 GEM (nGEM) 모델 15을 개발했다. 목적 표현형 I에서 전임상 약물 개발을위한 시험 관내 및 생체 내 모두에서 특징 및 잠재적으로 이용 될 수있는 유 전적으로 정의 성상 세포종 세포 모델을 생성 할 수 있었다mmune 능력있는 마우스.
설립 인간의 세포 라인 그들은 곧장 앞으로, 기술적으로 널리 사용할 수 있습니다. 성상 세포종의 발병 기전 및 생체 외 및 생체 내에서 약물 반응의 가장 일반적으로 사용되는 모델이며, 면역 결핍 쥐 10,11,16-18에서 소성을 xenografting에 따라 반응 속도와 발암을 정의한 . 이들 단점은 높은 성상 세포종에 연구를 제한 뇌 성상 세포종에서 확립 세포주를 생성하는 무능력을 포함한다; 기원의 정의 셀의 부족; 종종 원래의 환자 샘플에서 현저하게 차이가 게놈 프로파일 복잡한 게놈 이상의 존재; 그리고 감수성 혈청 11,17,19-22 직렬 문화 중 표현형 및 유전자형 드리프트. 설립 인간의 GBM 세포 라인의 개별 종양 돌연변이의 표현형의 결과는 종종 eluc을 배제 실제로 존재하는 이상,의 무리에 의해 마스크 될 수있다직접 유전자형 – 표현형 결과의 idation.
PDX는 면역 결핍 마우스 또는 면역 결핍 생쥐 12,23의 뇌에 소성을 주입 이전에 정의 된 무 혈청 배지에서 비 부착 회전 타원체로 그들의 문화를 통해 환자 격리 성상 세포종 세포의 피하 통로를 통해 생성됩니다. PDX보다 정확하게 인간 성상 세포종의 게놈 프리를 유지하지만, 인간의 확립 세포주 유사한 개별 발암 돌연변이 표현형 효과는 그들의 게놈 19,24 복잡성으로 인해 마스크 할 수있다. 특히 신규 한 치료법에 대한 응답으로, 특정 종양 돌연변이 표현형 결과를 정의하는 확립 인간 세포주 또는 PDX의 패널은 자주, 유전자형 표현형의 상관 관계를 확립 일반화를 보여주고, 세포주 특정 효과의 가능성을 최소화하기 위해 이용된다. PDX 정확하게 인간의 별아교 세포종, INC의 조직 병리학 적 특징을 요점을 되풀이하는 동안내습 luding 확립 인간 세포주의 동 소성은 일반적으로 이종 이식편을 수행하지 21,23,25. 또한, 정상적인 인간의 성상 및 NSC는 시험관 및 생체 내 13,14,26에서 성상 세포종의 종양을 모델로 정의 된 발암 돌연변이 유전자 설계되었다. 이러한 세포는 인간의 확립 세포주 및 PDX 게놈의 복잡성이 부족하고 정확하게 인간 성상 세포종의 조직 병리학 요점을 되풀이하지만, 생체 내에서 면역 결핍 설치류 xenografting을 필요로한다. 인간의 모든 세포 모델은 면역 매개 이종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 면역 결핍 쥐 호스트를 요구하기 때문에,이 모델은 기질 타겟팅 및 면역 조절 성 전임상 연구를 제한 동계 체제의 기본 종양 기질 상호 작용을 요점을 되풀이하는 데 실패하고 그대로 면역 체계 부족 10, 11를 치료.
종양 무타 소정 조합의 표현형 결과의 GEM 허가 심사현장 종양에있는 동안 생체 내에서 tions. 비 조건부 GEM 개발을 통해 모든 조직 내에서 돌연변이를 가지고있는 반면, 조건부 GEM은 세포 유형 – 특이 적 프로모터 10,11,15,18의 사용을 통해 특정 세포 유형에 Cre 호텔 매개 재결합을 제한하여 돌연변이의 대상으로 사용 발암 대립 유전자를 floxed있다. 조건부 성상 세포종의 GEM은 그대로 뇌 (11) 내에서 서로 다른 종류의 세포에 발암 성 변이의 기능적 역할을 규명하기 위해 이용되고있다. 조건부 GEM을 사용 시츄 gliomagenesis에서의 전임상 유틸리티 1) 생체 외 상관 관계의 부족, 복합 유전형과 시츄 종양 발생에서의, 3) 긴 레이턴시를 마우스의 큰 코호트를 생성하는 2)의 어려움을 포함하여 많은 요인에 의해 제한된다 4) 확률 적 종양 진행. 반응계에서 종양이 대응 관내 모델이 부족하기 때문에, 시험 관내 시험은 약물 w 수행 할 수없는기존의 i 번째 조건 GEM 모델. 다른 암과는 대조적으로, 성상 세포종의 조건부 GEM 모델은 거의 하나의 종양 유전자 돌연변이 (11)에 의해 유도되지 않는다. 따라서, 복잡한 사육 방식은 여러 종양 돌연변이 조건부 GEM을 생성해야합니다. 높은 성상 세포종으로의 진행은 일반적으로 불균일, 확률 적으로 발생하고 궁극적 복잡한 게놈 경관과 빠른 성장 동역학 (27)과 종양 상승을 제공하면서 또한, 성상 세포종 개시는이 모델에서 오랜 지연 기간 후에 가변 투과도 발생, 28. 조건부 GEM 모델에서 변수 투과도 및 악성 진행의 확률 적 특성은 개별 쥐가 임상 약물 시험에서 자신의 등록 전에 높은 성상 세포종의 존재 및 위치를 검출하기 위해 방사선 촬영으로 검사를해야합니다. 함께 찍은, 이러한 제한은 홍보에 필요한 생성 및 조건 GEM의 대규모 코호트 시험을 방해e 임상 약물 검사.
특정 신경 세포 유형의 바이러스 성 수용체 (TVA)를 표현하기 위해 설계 GEM 감염 조류 레트로 바이러스 (RCA 단자) 벡터를 이용하여 RCA 단자-TVA의 GEM 시스템은 광범위하게 성상 세포종의 종양 (11)를 모델로 활용되고 있습니다. 조건부 GEM과 대조적으로,이 모델 시스템은 복잡한 육종 계획에 대한 요구없이 특정 세포 유형에서의 다중 발암 돌연변이의 도입을 가능하게한다. 그러나, 가변 투과도 적극적 바이러스 통합을 달성하기 위해 세포를 분할하기위한 요구, 및 숙주 게놈 (29)에 도입 유전자의 임의의 삽입에 의해 제한된다.
그들은 다른 모델 시스템 (15)의 많은 한계를 극복하기 때문에 GEM에서 수확 세포를 활용하는 비 생식 GEM (nGEM) 모델은 점점 더 중요 해지고있다. 성상 세포종의 병인 세포 유형과 공동 발생 돌연변이를 개시 역할 억제하기 어렵다이들은 악성 진행 중에 미정 세포 유형에서의 광범위한 유전 적 돌연변이를 축적 말기 종양으로부터 유도되기 때문에 내 인간 GBM 세포주 또는 PDX 설립 사용. 대조적으로, 성상 세포종 모든 등급은 특정 정제 뇌 세포 유형 11,30 내에 유전 변이를 유도함으로써 nGEM 정의를 사용하여 모델링 될 수있다. 따라서, 특정 유전자 돌연변이 세포 및 분자 표현형에 세포 유형의 영향을 시험 관내 및 생체 내에서 결정될 수있다. 설립 된 인간 GBM 세포주와 유사 nGEM를 사용 초기 시험 관내 약물 테스트는 동일한 셀을 이용한 생체 내 테스트에 대한 약물의 우선 순위를 사용할 수있다. 생체 내에서 종양 형성 후 orthotopically 면역 능력 한배 새끼 동계 (30)의 뇌에 nGEM 세포 동종 이식에 의해 결정될 수있다. 이러한 동 소성 이식 모델은 따라서뿐만 아니라 종래의 세포 상해의 생체 내 시험에서 허용차 치료를 대상으로하지만, 면역 조절 성 간질 – 표적으로 한 치료뿐만 아니라. 마지막으로, 종양의 개시 및 진행에 미세 환경의 역할은 동일 세포 유형에서 동일한 변이를 사용 nGEM 종래 GEM 모델 사이의 결과를 비교함으로써 결정될 수있다.
우리와 다른 일차 전지를 사용하여 성상 세포종 nGEM을 개발했다 – 성상, NSC, 또는 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (OPC) – GEM 30-34에서 수확을. 성상 세포종 nGEM 개발 배후의 이론적 근거는 잠재적 면역 유능한 동물에서 시험 관내 약물 전임상 시험 및 생체 내에서 사용될 수있는 특정 유형의 세포에서 발암 돌연변이 표현형 결과를 결정하는 모델을 생성 하였다. 사포닌에 loxP /에 loxP 또는 TgGZT – 우리는 표현 표현형 WT 대뇌 피질의 성상 세포 및 비 Cre 호텔에서 NSC, floxed RB 경로와> 94 % C57 / BL6 배경에 유지 조건 GEM 수확121 – 다양한 조합 35-39에서 유전자 – NF1에 loxP /에 loxP, Kras은 G12D, PTEN을에 loxP /에 loxP – 및 RTK / RAS / PI3K 통로를 floxed. 우리는 Cre 호텔 재조합 효소를 암호화하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 시험 관내에서 유전자 재조합을 유도. 대뇌 피질의 성상 세포 수확은 세포 유형의 혼합물을 포함하기 때문에, 우리는이 문화 GFAP + 대뇌 피질의 성상 세포에 풍부하게, 같은 TgGZT 인간 GFAP 프로모터에서 쫓겨 121 Ad5GFAPCre 벡터 지배적 발암 유전자를 사용했다. 우리는 생체 외 및 생체 내에서 대뇌 피질의 성상 및 NSC의 표현형 G 1 / S의 결과 (굽은), MAPK와 PI3K 통로 돌연변이를 정의했다. MAPK 및 PI3K 경로 활성 G1 / S 불량 아스트로 분자 모방 proneural 인간의 GBM과, 소성을 주입하면, 균일 한 성장 동역학, 짧은 대기 시간을 가진 사전 정의 된 위치에 형성된 종양 및 조직 병리학인간의 GBM (30)의 알 특징. 생체 내에서 종양 성장의 종 모니터링 치료 40 님의 질문에 답변 처리 동료와 종양 성장의 정량 분석의 정상화를 통해 전임상 약물 검사를 도움이됩니다. 우리는 루시퍼 라제는 대뇌 피질의 성상을 표현 주입 한 쥐의 종 생물 발광 영상으로 종양의 성장 속도론을 결정했다. 따라서 조건부 GEM에서 파생 된 대뇌 피질의 성상 및 NSC는 성상 세포종 관련 돌연변이의 기능적인 결과와 임상 약물 개발을위한 잠재적 인 모델 시스템의 정의에 대한 다루기 쉬운 모델 시스템을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가장 중요한 단계, 2), 3) 철저히 세포를 떼어 놓다, 수막을 제거하는 뇌량 아래 조직을 고려하지 않고 피질을 절제하는 적절한 수확 및 대뇌 피질의 성상 세포의 배양 아르 일)을 보장하기 위해, 4) GFAP에 대한 풍부 + 성상 교세포. 우리는 GFAP + 성상 세포에 대한 풍부 방법 (GFAP 프로모터의 제어하에 (지배적 인 변형 유전자의 Ad5GFAPCre 벡터 또는 활용과 TgGZT 121)를 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
References
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