Modellering astrocytom Patogenese<em> In Vitro</em> Og<em> In Vivo</em> Bruke kortikal astrocytter eller nevrale stamceller fra Betinget, Genetisk konstruert Mus

Summary

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Abstract

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Introduction

Astrocytomas er den vanligste primære hjernesvulst og glioblastom (GBM), en klasse IV astrocytom, er den vanligste og aggressiv subtype med en median overlevelse på 12-15 måneder ^1,2. Invasjonen av diffuse astrocytomas, særlig GBM, utelukker komplett kirurgisk reseksjon, begrenser effekten av adjuvant behandling, og fører uunngåelig til etter behandling tilbakefall ^tre. Pasienter utgangspunktet stede enten med de novo (primær) GBM eller med lavere klasse astrocytomas som uunngåelig utvikler seg til (sekundær) GBM ^fire. GBM er genomisk heterogen og preget av gjensidig utelukkende og co-forekommende mutasjoner i gener som styrer tre sentrale signalveier: G ₁ / S (RB) cellesyklus sjekkpunkt, reseptor tyrosin kinase (RTK), og TP53 trasé ^5-7. GBM består av fire genomiske undergrupper med distinkt uttrykk profiler som ligner forskjellige hjernecelletyper, noe som tyder på at GBM subtype er influenced av sin celle opprinnelses ^6,8,9. Bedre astrocytom modeller er påkrevet for å definere rollen til spesifikke kombinasjoner av mutasjoner i bestemte celletyper under astrocytom patogenesen. Utnytte disse modellene for mer effektiv preklinisk utvikling av legemidler til slutt vil bidra til å forbedre pasientens utfall. Gjeldende astrocytom modellene er etablert humane cellelinjer, pasient avledet xenografts (PDX), genmodifiserte normale menneskelige astrocytter og nevrale stamceller (NSC), og genmanipulerte mus (GEM) ^10-14. Vi utviklet en alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) modell ¹⁵ utnytte primære hjerneceller – kortikale astrocytter og NSC – høstet fra GEM husing ulike kombinasjoner av floxed onkogene alleler. Målet var å generere astrocytom modeller med genetisk definerte celler som kan være fenotypisk kjennetegnet både in vitro og in vivo, og eventuelt benyttes for preklinisk utvikling av legemidler i immune-kompetente mus.

Etablerte humane cellelinjer er den mest brukte modellen av astrocytom patogenesen og narkotika respons in vitro og in vivo. De er teknisk sett rett frem, allment tilgjengelig, og har definert kinetikk og tumorigenisitet ved orthotopic xenografting i immunodeficient mus ^10,11,16-18 . Deres ulemper omfatte manglende evne til å generere etablerte cellelinjer fra lavgradige astrocytomas, begrense studien bare høygradig astrocytomas; Mangelen på en definert celle opprinnelse; tilstedeværelse av komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomisk profiler som avviker vesentlig fra den opprinnelige pasientprøve; og mottakelighet for fenotypisk og genotypisk drift under serie kultur i serum ^11,17,19-22. De fenotypiske konsekvenser av enkelte onkogene mutasjoner i etablerte menneske GBM cellelinjer kan være maskert av de mange forandringer som faktisk er til stede, som ofte utelukker elucidation av direkte genotype-fenotype konsekvenser.

PDX er generert gjennom subkutan passasje av pasient isolert astrocytom celler i immundefekte mus eller gjennom deres kultur som ikke-adherente sfæroider i definert, serumfritt medium før det orthotopic injeksjon i hjernen hos mus immunodeficient ^12,23. PDX mer nøyaktig opprettholde det genomiske landskap av humane astrocytomer, men ligner på etablerte humane cellelinjer, kan den fenotypiske effekten av individuelle onkogene mutasjoner bli maskert på grunn av deres genomiske kompleksitet ^19,24. For å definere de fenotypiske konsekvenser av spesifikke onkogene mutasjoner, spesielt i respons mot nye behandlinger, blir paneler av etablerte humane cellelinjer eller PDX ofte benyttet for å etablere korrelasjoner genotype-fenotype, viser generalizability, og reduserer mulighetene for at cellelinjespesifikke effekter. Mens PDX nøyaktig rekapitulere de histopatologiske kjennetegnene ved menneskelig astrocytomas, incLuding invasjon, ortotopiske xenografts av etablerte humane cellelinjer generelt ikke ^21,23,25. I tillegg normale menneskelige astrocytter og NSC har blitt genetisk konstruert med definerte onkogene mutasjoner å modellere astrocytom tumorigenesis in vitro og in vivo ^13,14,26. Disse cellene mangler genomisk kompleksitet etablerte humane cellelinjer og PDX og nøyaktig rekapitulere menneskelig astrocytom histopatologi, men krever xenografting i immunsvikt gnagere in vivo. Fordi alle menneskelige cellemodeller krever immunsvikt gnager verter å hindre immunmediert xenograft avvisning, disse modellene ikke klarer å rekapitulere de innfødte tumor-Stroma interaksjoner av en syngene system og mangler et intakt immunforsvar, noe som begrenser preklinisk undersøkelse av stroma-målrettet og immun-moduler therapies ^10,11.

GEM tillatelse undersøkelse av fenotypiske konsekvensene av forhåndsbestemte kombinasjoner av onkogene mutasjoner i vivo under in situ tumorigenesis. Mens ikke-betinget GEM har mutasjoner i alle vev i hele utvikling, har betinget GEM floxed onkogene alleler som muliggjør målretting av mutasjoner ved å begrense Cre-mediert rekombinasjon til bestemte celletyper ved bruk av celletypespesifikke arrangører ^10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM har blitt benyttet til å belyse de funksjonelle roller av onkogene mutasjoner i forskjellige celletyper innen et intakt hjernen ^11. Den prekliniske nytten av in situ ved å bruke betinget gliomagenesis GEM er begrenset av en rekke faktorer, inkludert 1) mangel på en in vitro korrelerer, 2) vanskeligheter med å generere store kullene av mus med komplekse genotyper, 3) lang ventetid for in situ tumorutvikling , 4) og stokastisk tumorprogresjon. Fordi in situ tumorigenesis mangler en tilsvarende in vitro-modell, kan stoffet testing in vitro ikke utføres wed konvensjonelle betingede GEM modeller. I motsetning til andre kreftformer, er betinget GEM modeller av astrocytomer sjelden indusert av enkle onkogene mutasjoner ^11. Således er komplekse avl ordninger som kreves for å generere betinget GEM med flere onkogene mutasjoner. Videre oppstår astrocytom initiering med variabel pene etter en lang latenstid i disse modellene, mens progresjon til høyverdige astrocytomer vanligvis forekommer i et ikke-uniformt, stokastisk måte og til slutt gir opphav til svulster med komplekse genomiske landskap og hurtige vekstkinetikk ^{27, 28.} Den variable pene og stokastisk natur ondartet progresjon i betingede GEM-modeller krever at enkelt mus bli skjermet av radiografisk å påvise tilstedeværelse og plassering av høy klasse astrocytomas før deres innmelding i prekliniske legemiddelutprøvninger. Samlet utgjør disse begrensninger hindre generering og testing av de store årskull av betinget GEM kreves for preclinical narkotika testing.

Den RCAs-TVA GEM system, som benytter avian retrovirale (RCAs) vektorer å infisere GEM konstruert for å uttrykke viral reseptor (TVA) på bestemte nervecelletyper, har blitt grundig brukt til å modellere astrocytom tumorigenesis ^11. I motsetning til betinget GEM, muliggjør dette modellsystem innføring av multiple onkogene mutasjoner i spesifikke typer celler uten behov for kompliserte avl ordninger. Det er imidlertid begrenset av variabel penetrans, kravet for aktivt delende celler for å oppnå viral integrering, og tilfeldig innsetting av transgener i vertsgenomet ^29.

Non-germline GEM (nGEM) modeller, som utnytter celler høstet fra GEM, blir stadig viktigere fordi de overvinne mange av begrensningene i modell andre systemer ^15. Rollen initiere celletype og co-forekommende mutasjoner i astrocytom patogenesen er vanskelig å avskrekkemin ved anvendelse av etablerte humane cellelinjer eller GBM PDX fordi de er utledet fra utgangen av scene tumorer som har akkumulert omfattende genetiske mutasjoner i udefinerte celletyper i løpet av malign progresjon. I kontrast, kan alle graderinger av astrocytomas modelleres ved hjelp nGEM ved å fremkalle definert genetiske mutasjoner innenfor bestemte rensede hjernecelletyper ^11,30. Således kan påvirkningen av spesifikke genetiske mutasjoner og celletype på cellulære og molekylære fenotyper bestemmes in vitro og in vivo. I likhet med etablerte humane GBM cellelinjer, kan begynnende in vitro medikamenttesting ved hjelp nGEM brukes til å prioritere legemidler for in vivo tester som benytter de samme cellene. Tumorigenesis in vivo kan da bli bestemt av allografting nGEM celler orthotopically inn i hjernen til immunkompetente syngene kullsøsken ^30. Disse ortotopiske allograft modeller tillater derfor in vivo testing, ikke bare av cytotoksisk en konvensjonellnd målrettet terapi, men immun-modulerende og Stroma målrettede behandlinger også. Endelig kan rollen til mikromiljøet på tumor initiering og progresjon bestemmes ved å sammenligne resultatene mellom nGEM og konvensjonelle GEM-modeller ved å bruke de samme mutasjoner i de samme celletyper.

Vi og andre har utviklet astrocytom nGEM bruker primærceller – astrocytter, NSC, eller oligodendrocyte forløper celler (OPC) – høstet fra GEM ^30-34. Begrunnelsen bak utviklingen av et astrocytom nGEM var å lage en modell for å bestemme fenotypiske konsekvensene av onkogene mutasjoner i bestemte celletyper som potensielt kan brukes til preklinisk narkotika testing in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstet fenotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre uttrykker, betinget GEM opprettholdes på en> 94% C57 / BL6 bakgrunn med floxed RB sti – Rb1 ^{loxP / loxP,} eller TgGZT121 – og floxed RTK / RAS / PI3K pathway – NF1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, PTEN ^{loxP / loxP} – gener i ulike kombinasjoner ^35-39. Vi indusert genetisk rekombinasjon in vitro ved hjelp av adenovirale vektorer som koder for Cre rekombinase. Fordi kortikale astrocyte avlinger inneholder en blanding av celletyper, brukte vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, slik som TgGZT ₁₂₁ drevet fra den menneskelige GFAP promoter, for å berike for GFAP ⁺ kortikale astrocytter i disse kulturene. Vi definerte fenotypiske konsekvensene av G ₁ / S (RB), MAPK, og PI3K pathway mutasjoner i kortikale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K sti-aktivert G1 / S-defekte astrocytter molekylært etterlignet menneske proneural GBM, og ved orthotopic injeksjon, dannet svulster i et forhåndsdefinert sted ensartede vekstkinetikk, korte ventetider, og histopatologiskeal kjennetegnene ved menneskelig GBM ^30. Langsgående overvåking av tumorvekst in vivo hjelpemidler preklinisk narkotika testing gjennom normalisering av behandlings kohorter og kvantitativ analyse av tumorvekst i respons på behandlingen ^40. Vi bestemt tumorvekst kinetikk ved langsgående bioluminesens avbildning av mus injisert med luciferase uttrykke kortikale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC avledet fra betinget GEM gi en medgjørlig modellsystem for definisjon av funksjonelle konsekvenser av astrocytom mutasjoner og en potensiell modellsystem for preklinisk narkotika utvikling.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av University of North Carolina Institutional Animal Care og bruk komité. 1. dyrking kortikal astrocytter fra Neonatal Mus Forberedelse Krølle 2-3 delikat oppgave vev og plasseres i bunnen av en flaske inneholdende 70% etanol. Plasser disseksjonssaksen, buede pinsett og 2 par rette mikro tang inn i denne flasken. Vevene blir brukt for å unngå bøying mikro tang. Tilsett 1 ml HBSS til en 60 mm vevskultur-fatet. Forbered en egen r…

Representative Results

Vi utviklet en nGEM modellsystem med kortikale astrocytter og NSC høstet fra neonatal GEM husing floxed betingede onkogene alleler som kan fenotypisk preget in vitro og in vivo (Figur 1). For å undersøke konsekvensene av onkogene mutasjoner spesielt i kortikale astrocytter in vitro, er det avgjørende å først berike for astrocytter. Kortikale astrocyte avlinger inneholder en blanding av mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter, OPC, og nerveceller, men mekaniske og genet…

Discussion

De mest kritiske trinn for å sikre riktig og høsting av kulturen kortikale astrocytter er 1) for å skjære barken uten å ta vev under corpus callosum, 2) for å fjerne hjernehinnene, 3) for å grundig dissosiere cellene, og 4) å anrike for GFAP ⁺ astrocytter. Selv om vi brukte mekanisk (risting) og genetisk (begrensning av genetisk rekombinasjon med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttelse av en dominerende transformerende transgenet (TgGZT ₁₂₁₎ under GFAP promoter kontroll) met…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Invitrogen	11995065	DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular	Cellgro	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4	Miltex	17-301
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2710
Razor Blades	VWR	55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Invitrogen	12605-010	Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
CULTURE DISH, 60 x 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
15 ml tubes	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	BD Biosciences	352070
Adenovirus stock	Gene Transfer Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous.  Use Bsl2 safetyy  precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)	Sigma-Aldrich	238597
Potassium sulfate (K2SO4)	Sigma-Aldrich	221325
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	746495
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
D-(+)- Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P3532
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Papain	Worthington	LS003127
L-Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size)	Millipore	SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse	Stemcell Technologies	5702	This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	Invitrogen	14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size)	Corning	352340
Stem cell dissociation solution	Stemcell Technologies	5707	Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X	Millipore	SLM-202-B	For making 5% methyl cellulose solution
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser	Hamilton	83700
Disposable 18 ga needles	Fisher Scientific	NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Betadine	Fisher Scientific	NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	Tissue adhesive
Lidocaine	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3580
Anti-Sox2	Millipore	AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		For in vivo imaging
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122796	For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro	Addgene	18782