Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Single-molecule microscopie is in opkomst als een krachtige aanpak van het gedrag van signaalmoleculen, in het bijzonder met betrekking tot die aspecten (bv.., Kinetiek, naast elkaar bestaan van verschillende staten en bevolkingsgroepen, voorbijgaande interacties), die typisch zijn verborgen in ensemble-metingen, zoals analyseren die verkregen met standaard biochemische methoden of microscopie. Aldus thermische, zoals receptor-receptor-interacties, kunnen worden gevolgd in real time in een levende cel met hoge resolutie spatiotemporal. Dit protocol beschrijft een methode waarbij merken met kleine en lichte organische fluoroforen en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie direct visualiseren enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om precies receptoren lokaliseren, meten van de grootte van de receptor complexen, en vangen dynamische evenementen zoals transient receptor-receptor interacties. Het protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe u perform een single-molecule experiment, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en beeldanalyse. Als voorbeeld, de toepassing van deze methode twee G-eiwit-gekoppelde receptoren te analyseren, dwz., Β 2-adrenerge en γ-aminobutyric acid type B (GABA B) receptor, wordt gerapporteerd. Het protocol kan worden aangepast aan andere membraaneiwitten en verschillende celmodellen, transfectie en etikettering strategieën.
Introduction
Receptoren op het celoppervlak zin de extracellulaire omgeving en reageren op verschillende stimuli, zoals geurstoffen, ionen, kleine neurotransmitters en hormonen groot eiwit. De vloeibare aard van cellulaire membranen maakt bewegingen van receptoren en andere membraaneiwitten. Dit is essentieel voor de vorming van eiwitcomplexen en het optreden van transiënte eiwit-eiwit interacties, zoals die gebruikt door receptoren te assembleren in functionele eenheden en transduceren signalen in de cel interieur. Bijvoorbeeld, G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's), die de grootste familie van celoppervlak receptoren 1 vormen, zijn voorgesteld om di-/oligomers, die lijkt te worden betrokken bij de fijnafstemming regulatie van signaaltransductie en vorm belangrijke fysiologische en farmacologische gevolgen zou kunnen hebben 2-5.
Single-molecule microscopie heeft het grote potentieel van direct visualiseren met een hoge spatiotemporale oplossing het dynamische gedrag van individuele receptoren op het oppervlak van levende cellen, met inbegrip van hun associatie met dimeren en hogere orde moleculaire complexen 6-10 vormen. Dit biedt verschillende voordelen ten opzichte van standaard biochemische en microscopie methoden, die gewoonlijk rapporteren de gemiddelde gedrag van duizenden of miljoenen moleculen.
Eiwit labeling met een voldoende heldere en fotostabiel fluorofoor is essentieel voor single-molecule microscopie. Dit protocol maakt gebruik van de onlangs geïntroduceerde SNAP-tag 11 covalent hechten kleine en lichte organische fluoroforen aan celoppervlak receptoren. SNAP is een 20 kD eiwit tag afkomstig van het menselijk DNA-reparatie-enzym O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, die onomkeerbaar kunnen worden gelabeld met fluorofoor-geconjugeerde benzylguanine (fluorofoor-BG) derivaten. CLIP, een verder ontwikkeld tag afgeleid van SNAP, kan in plaats daarvan worden gelabeld met fluorofoor-conjugated benzylcytosine derivaten 12.
Het protocol beschreven in dit manuscript uitgelegd hoe transfecteren en label SNAP-11 receptoren gelabeld met kleine organische fluoroforen en gebruik totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie enkele receptoren of receptor complexen zichtbaar op het oppervlak van levende cellen 10. De gerapporteerde resultaten protocol in> 90% labelingsefficiëntie een extracellulair SNAP-gelabeld eiwit van het celoppervlak 10. Nadere informatie over individuele molecuul gegevens gebruiken om de omvang en de mobiliteit van receptor complexen te analyseren, evenals transient receptor-receptor-interacties te vangen, is voorzien. Een schematische werkstroom van het gehele protocol is gegeven in figuur 1. Als voorbeeld, de transfectie van Chinese hamster ovarium (CHO) cellen met SNAP-gemerkte G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), gevolgd door het merken met een fluorofoor-BG derivaat als alsmede de toepassing ervan op quantify en de monitor receptor di-/oligomerization worden beschreven. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere cel-oppervlakte-eiwitten en fluorescerende labels (bijv.. CLIP), alsmede andere transfectie en etikettering methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven protocol maakt analyse van de ruimtelijke ordening, mobiliteit en grootte van celoppervlak receptor-complexen bij individuele molecuul. Vergeleken met het gebruik van fluorescente proteïnen, labeling met kleine organische fluoroforen, die helderder en fotostabiel zijn, heeft het voordeel van het toestaan uitgebreide visualisatie van een enkele receptor deeltjes. Aangezien extreem lage expressieniveaus worden verkregen (<0,45 receptor deeltjes / um 2) de eigenschappen van receptoren en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
